[发明专利]一种数字ELISA系统及其使用方法

说明书

本发明提供一种数字ELISA系统，包括：自动化加样模块，包括移动平台、可拆卸基板、基底芯片以及可控制压载板；集成光检测模块，包括激发光源、单色器、用于测量荧光并用于拍摄基底芯片的普通图像和荧光图像的检测器和光强信号分析器；以及数字化计算模块，与光强信号分析器通信连接；其中，基底芯片表面设置有微孔阵列和废液槽，微孔具有三维形状，其开口从下往上逐渐变大，且至少一面侧壁为倾斜壁，全部或部分微孔内靠近底部的位置固定有至少一个珠。本发明还提供一种数字ELISA系统的使用方法，包括：采用自动化加样模块进行加样，待加样完成后，采用集成光检测系统进行检测，得到数字化信号，最后将数字化信号带入数字化计算模块，得到蛋白定量结果。

技术领域

本发明属于体外分子诊断领域，具体涉及一种数字ELISA系统 及其使用方法。

背景技术

分子生物学是在分子水平(核酸、蛋白质等)上研究分子结构、 功能和生物合成等功能来阐明各种生命本质现象的科学。基于珠材料 的免疫测定方法是蛋白质检测的一项新进展，相比基于平坦2D板免 疫测定具有更高的灵敏度。数字酶联免疫反应(enzymelinked immunosorbent assay，ELISA)是一种蛋白质单分子检测、定量的新 方法，将蛋白质检测技术直接带入到单分子、数字化时代，为飞克级甚至更低的超低丰度蛋白质检测提供了可能。数字ELISA以磁珠为 固相载体，针对抗体-抗原-酶标复合物进行数字化分隔，利用酶催化 底物反应的生物放大作用，提高抗原抗体免疫学反应检测的灵敏度， 通过计算阳性底物的泊松分布结果可以获得蛋白质分子的绝对浓度。 该技术的关键在于每个固相载体(磁珠)上所进行的酶催化反应是相 互独立的，以此来提高检测灵敏性，完成对单分子检测和定量功能。 数字ELISA具备优秀的蛋白质检测和定量的能力，是目前高灵敏度 的免疫分析技术之一，广泛应用在生命科学、体外诊断、伴随诊断、 血液筛查、药物研发等领域，为疾病早期筛查和预后评估提供了一种重要途径。精确检测超低丰度蛋白在多种类的肿瘤标志物、癌症分型 等方面，发挥着重要作用，对预判疾病的发生与转归有着重大意义。 基于数字式单分子酶联免疫阵列技术的Simoa(Single-molecule Array)是数字ELISA技术中的典型代表，较传统的ELISA检测灵敏 度提高了1000倍以上，是目前用于超灵敏蛋白质检测的金标准工具。 数字ELISA以磁珠为固相载体，检测步骤可分为捕获、封装、成像三步，磁珠控制系统复杂且设备体积大，磁珠装载效率低，洗涤和装 载过程复合物结构的稳定性受到影响，导致检测灵敏度下降，检测成 像系统笨重且复杂，制约着微小型、便携、自动化操作的数字ELISA 系统的发展，很难满足广泛的应用需求(如：现场快速检测、家庭及 时护理(point ofcare test，POCT)等)。数字ELISA中的关键技术包 括三个重要部分：1)珠装载效率；2)复合物结构稳定性；3)自动 化快速检测。三个关键技术影响了数字ELISA向微小型化和便携化 的发展，已有的文献报道在这三个方面均开展了大量的研究探索，主要包括：Simoa、孔板式数字ELISA、连续流式数字ELISA、快速检 测数字ELISA。

Simoa是目前用于检测超灵敏蛋白质的金标准工具，然而，磁珠 装载率低，有效计数比例低，有限的采样和计数数量，导致靶分子检 测灵敏度下降，限制了检测和发现生物标志物的能力。磁珠在洗涤过 程和进入微孔过程中，免疫复合物结构很容易被破坏，生成和分割稳定性受到影响。另外，仪器成本超过100,000美元，设备体积大、成 本高，笨重的光学器件和复杂的液体处理仪器影响了该技术的普及使 用。

孔板式数字ELISA通过设计微流控芯片结构提高了磁珠装载效 率，增大了有效计数比例，但是芯片制造工艺和使用设备复杂，无疑 影响了便携化/自动化操作方向的发展；蛋白结合稳定性仍然摆脱不了磁珠洗涤的方式的影响。

连续流式数字ELISA将所有磁珠包裹进液滴中，磁珠装载效率 大大提高，所有磁珠均可有效计数分析，复合物结构分割稳定性得到 了提高，但是磁珠洗涤的方式仍然影响了蛋白结合的稳定性，生成、 控制和测量数百万个高通量液滴所必需的仪器非常复杂，融合、流道压力、密封等问题阻碍了高通量液滴的稳定性，微流控芯片外接的管 路及泵压设备阻碍了系统微小型化/便携性。