[发明专利]用于鉴定鲜食樱桃常见蝇类的LAMP引物组及其应用

说明书

本发明公开了用于鉴定鲜食樱桃三种常见蝇类的LAMP引物组及其应用。所述LAMP引物组包括引物组SWD4、引物组OFF1和引物组ECFF4；核苷酸序列如序列表中序列1‑12所示。本发明的LAMP引物组可用于鉴定待测蝇类是否属于鲜食樱桃三种常见蝇类——斑翅果蝇、橘小实蝇、欧洲樱桃实蝇，也可应用于检测待测样本是否含有鲜食樱桃三种常见蝇类——斑翅果蝇、橘小实蝇、欧洲樱桃实蝇，还可用于区分鲜食樱桃三种常见蝇类——斑翅果蝇、橘小实蝇、欧洲樱桃实蝇。本发明的LAMP引物组具有高特异性和高灵敏度，可以实现简便、快速、准确检测，对鲜食樱桃产业及商品樱桃贸易具有重要意义。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及用于鉴定鲜食樱桃常见蝇类的LAMP引物组及其应用，特别涉及用于鉴定鲜食樱桃三种常见蝇类——斑翅果蝇、橘小实蝇、欧洲樱桃实蝇的LAMP引物组及其应用。

背景技术

斑翅果蝇、橘小实蝇、欧洲樱桃实蝇是鲜食樱桃中常见的检疫性蝇类。斑翅果蝇Drosophila suzukii(Matsumura)(Diptera:Drosophilidae)，又名铃木氏果蝇、樱桃果蝇，英文名Spotted Wing Drosophila(SWD)，是极受关注的世界性害虫，隶属于双翅目、环列亚目、果蝇科、果蝇属、水果果蝇亚属、黑腹果蝇种组。斑翅果蝇寄主广泛，涉及18个科60余种植物，包括蓝莓、黑莓、红树莓、樱桃、草莓、李子、桃子、葡萄、无花果、猕猴桃、梨等。幼虫分为三个龄期，每龄期幼虫体长分别约为0.67×0.17mm、2.13×0.40mm和3.94×0.88mm。橘小实蝇Bactrocera dorsalis(Hendel)，又名Oriental Fruit Fly，隶属双翅目、实蝇科、果实蝇属，该虫为多食性害虫，可取食柑橘、番石榴、芒果、樱桃等46科250多种水果蔬菜。橘小实蝇原产于亚洲的热带地区，现分布范围广，涉及亚太地区和非洲地区的热带、亚热带和温带地域。幼虫分为三个龄期，幼虫体长范围0.588-9.700mm。欧洲樱桃实蝇Rhagoletis cerasi(L.)隶属于双翅目、实蝇科、绕实蝇属。欧洲甜樱桃和忍冬是其主要的寄主植物，在我国尚未有欧洲樱桃实蝇的分布。

斑翅果蝇、橘小实蝇、欧洲樱桃实蝇不仅能够对成熟或亚成熟的果实进行取食，其产卵器刺破果皮、幼虫在果实内部取食等都会使被害果实迅速开始腐烂，且会引发真菌、细菌二次侵染，加速腐烂，导致水果产量下降，品质变劣，安全性和商品价值受到严重影响。蝇类可在国际贸易中随着水果商品、包装等在世界范围内传播。因此，如何有效快速、准确地鉴别出蝇类的种类，对于鲜食樱桃保护领域的害虫监测和植物检疫领域的害虫鉴定等，显得尤为重要。

目前鲜食樱桃三种常见蝇类——斑翅果蝇、橘小实蝇、欧洲樱桃实蝇的鉴定方法主要采用传统的形态鉴定和分子鉴定技术。由于蝇类个体较小、幼虫难以区分，需要专业的形态学知识储备，使得形态鉴定非常困难。现有的PCR分子鉴定技术虽然可实现快速、准确的鉴定，但需昂贵的仪器设备，鉴定成本高，不适于在基层部门中推广应用。

环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是利用一种具有链置换活性和瀑布式核酸扩增功能的Bst DNA聚合酶，在等温条件下进行核酸的变性和自动循环的链置换核酸扩增反应。LAMP针对靶序列的6个区域设计4条特异引物，利用具备链置换功能的DNA聚合酶在恒定温度下不断复制扩增DNA。为了提高反应效率，可在反应体系中添加两条环引物，使之分别与茎环结构结合，启动链置换合成，循环复制。LAMP是一种简便高效的核酸恒温扩增技术，可以在短时间内大量扩增反应产物，具更高灵敏度，且操作简便，无需特殊仪器，检测结果可由肉眼观察判断，适于基层部门推广应用。LAMP中，引物是决定检测结果灵敏度和特异性的关键因素。

发明内容

本发明的目的是提供一种有效快速、准确地鉴定鲜食樱桃三种常见蝇类——斑翅果蝇、橘小实蝇、欧洲樱桃实蝇的方法及其所用成套引物组。

为了实现上述目的，本发明首先提供了用于鉴定或辅助鉴定鲜食樱桃三种蝇类的成套引物组。