[发明专利]一种基于Illumina测序平台的游离DNA文库构建用试剂盒及其应用

说明书

本发明提供了一种基于Illumina测序平台的游离DNA文库构建用试剂盒及其应用，属于基因测序技术领域。基于Illumina测序平台的游离DNA文库构建用试剂盒，包括末端修复和加A用酶组合物、末端修复和加A的缓冲液、连接酶、连接酶缓冲液、接头、PCR扩增反应混合液和引物。所述试剂盒采用国产原材料试剂自行配制反应组分，缩短了货期，降低了缺货风险和建库成本，简化了反应程序，同时将末端修复反应体系和加A反应体系合并在一个体系中，缩减了反应时间，提高了出库率。因此，本发明提供了试剂盒在DNA文库构建或高通量测序中的应用。

技术领域

本发明属于基因测序技术领域，具体涉及一种基于Illumina测序平台的游离DNA文库构建用试剂盒及其应用。

背景技术

二代测序(NGS)系统因其可同时进行大量平行测序反应而受到关注。虽然不同的二代测序平台在技术细节上有许多不同，但在测序前都需要建立DNA文库。所以获得合格的DNA文库是影响最终检测结果的重要因素。

目前，适用Illumina二代测序平台的建库试剂盒主要由Illumina、Roche、NEB等进口厂商提供。上述试剂盒构建文库的主要流程包括：对游离DNA末端补平、加A反应；连接接头；磁珠捕获片段；PCR富集，磁珠纯化PCR产物即可出库。但是这些构建文库试剂盒存在缺陷，例如货期长，缺货风险大和建库成本高等，导致测序时间受限制和成本大幅上升。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种新的、成本低、国产的用于基于Illumina测序平台的游离DNA文库构建用试剂盒及其应用，可以降低建库成本的同时保证测序时间。

本发明提供了一种基于Illumina测序平台的游离DNA文库构建用试剂盒，包括末端修复和加A用酶组合物、末端修复和加A的缓冲液、连接酶、连接酶缓冲液、接头、PCR扩增反应混合液和引物。

优选的，所述末端修复和加A用酶组合物包括T4多聚核苷酸激酶、T4DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶和Klenow片段；所述T4多聚核苷酸激酶的工作浓度为0.1～0.5U/μL；

所述T4 DNA聚合酶的工作浓度为0.04～0.1U/μL；

所述Taq DNA聚合酶的工作浓度为0.025～0.075U/μL；

所述Klenow片段的工作浓度为0.005～0.02U/μL。

优选的，所述末端修复和加A的缓冲液包括Tris-HCl、MgCl₂、DTT(二硫苏糖醇)、ATP、dNTP、dATP、PEG8000和水；

优选的，所述Tris-HCl的工作浓度为50～100mM；

所述MgCl₂的工作浓度为10～20mM；

所述DTT的工作浓度为5～10mM；

所述ATP的工作浓度为2～5mM；

所述dNTP的工作浓度为0.1～1mM；

所述dATP的工作浓度为1～10mM；

所述PEG8000的工作质量浓度为1％～10％。

优选的，所述连接酶为T4 DNA连接酶；

所述T4 DNA连接酶的工作浓度为15～60U/μL。

优选的，所述连接酶缓冲液包括Tris-HCl、MgCl₂、DTT、ATP和PEG 8000；

优选的，所述Tris-HCl的工作浓度为30～100mM；

所述MgCl₂的工作浓度为5～20mM；