[发明专利]用酶介导的放大的多路复用成像

说明书

用于对样品中的分析物进行成像的方法包括使生物样品与结合剂接触，其中结合剂包括与分析物结合的结合部分和第一核苷酸序列，使生物样品与催化剂接触，其中催化剂包括与酶连接的第二核苷酸序列，并且其中第二核苷酸序列与第一核苷酸序列杂交，使生物样品与定位剂接触，其中定位剂包括与酶互补的底物和连接至底物的第三核苷酸序列，以及使生物样品与标记剂接触，其中标记剂包括与光学标记物连接的第四核苷酸序列，其中第四核苷酸序列与第三核苷酸序列杂交。

相关申请的交叉引用

本申请要求于2019年9月30日提交的美国临时专利申请号62/908,540的优先权，其全部内容通过引用并入本文。

背景技术

在1942年，抗体首次用于组织切片分析，以可视化注入活细菌的小鼠器官活检中的肺炎球菌抗原。从那时起，免疫组织化学已成为临床诊断和基础研究的中流砥柱。

然而，常规的免疫组织化学(IHC)方法不一定能提供足够的信号用于检测，特别是对于弱表达或现有IHC试剂无法有效靶向的免疫靶物。

发明概述

本公开的特点在于用于对生物样品进行免疫组织化学的方法、物质组合物和试剂盒，其中酪酰胺(tyramide)信号放大以增强使用显色或荧光染料对靶物的检测，其中可以在检测后去除染料。多路复用检测(multiplexed detection)可以通过连续的几轮成像以高水平的多路复用(multiplexing)进行，其中每一轮成像可以检测对应于多个靶物的多种染料，并且放大可以用于任何或所有靶物。

在一些实施方案中，方法包括使用TSA方法将寡核苷酸序列酶介导沉积到样品上。因为与每个抗体分子偶联的酶部分可以催化许多寡序列分子沉积到样品上，这些方法实现了放大(即染料分子的量与靶分子的量的比率大于1:1)。可以对多种抗体重复该过程，从而提供多个寡核苷酸序列在样品上的TSA放大沉积。

引入一种或多种用反义寡核苷酸序列标记的染料，并与相应的(即互补的)TSA沉积的寡核苷酸序列杂交并检测该染料，之后可以将寡核苷酸标记的染料去杂交(dehybridize)并从样品中去除。可以任选地进行一轮或多轮额外的检测。

在一些实施方案中，样品与多种一抗一起温育，每种一抗靶向不同的感兴趣的分析物并定位于对应于样品中的靶分析物的位点。每种不同类型的抗体与独特的寡核苷酸序列S_i缀合，该序列取自一组N序列S＝{S₁,S₂...S_N}，其中组S是正交的，这意味着给定的S_i的反义序列S_i’在严格条件下基本上只与S_i杂交，而不与任何S_j杂交，其中i≠j。在序列S组的上下文中，“基本上”是指序列S_i’与除S_i之外的序列S_j的交叉结合的总量小于序列S_i’与序列S_i的结合量的1％。

封闭和清洗步骤可以在免疫组化抗体温育过程中进行，以最小化温育中的非特异性结合并随后去除多余的抗体。之后可以进行固定步骤，以将一抗更牢固地连接到样品上，并减少在后续步骤中去除它们的可能性。

如辣根过氧化物酶(HRP)的酶与反义序列S_i’缀合并应用于样品，其中反义序列S_i’通过沿至少第一结合区结合与连接至一抗的相应序列S_i杂交。严格或接近严格的条件可以用于最小化与样品中其他序列和/或其他位置的交叉杂交。因为一抗与取自正交组S的不同序列S_i缀合，所以很少或没有酶定位于特异性结合其他靶分析物的一抗。