[发明专利]生物学地封存的细菌及其用途

说明书

本公开提供了生物封存方法和机制，其防止经修饰的细胞从其预期的环境逃逸，同时使得所述细胞能够在预期的环境存活和复制。这是通过将所述经修饰的细胞的活力与外来地提供以限定细胞能够生长的位置和时间的控制分子相关联来实现的。

相关申请的交叉参考

本申请要求于2019年6月13日提交的美国临时专利申请序列号62/861，181的权益和优先权，该临时专利申请据此全文以引用方式并入本文。

背景技术

基于细胞的治疗是一种新兴的方法，可以在需要空间和时间特异性、逻辑和新活性、但是只能通过工程化整个细胞来开发的疾病中补充传统的基于小分子和蛋白质的疗法。基于细胞的治疗剂的一个独特挑战是以不干扰治疗功能但可将存活限制于限定的时间和空间的方式控制治疗细胞的复制。生物封存(biocontainment)是遗传修饰的细胞治疗剂的必要特征，由此治疗细胞被修饰为不能够在预期位置和/或持续时间之外进行繁殖。超过预期治疗时段存在或逃逸到环境或其他人中的治疗剂是必须解决的风险。

赋予适合性缺点的引入的突变(例如只能在实验室中补充的营养缺陷型)提供了生物封存的有效手段。然而，对于许多应用来说，需要细胞治疗剂在患者中是活性的，例如以胜过病原微生物或达到功效所需的丰度。为了确保细胞的体内可控地生长，已经设计了许多策略，其依赖于容易控制的环境信号(通常是小分子)的存在来产生活力。然而，迄今为止公布的大多数生物封存方法利用毒素，所述毒素在控制分子的存在下被诱导作为杀灭细胞的手段。这种方法存在两个缺点。首先，这些生物封存的细胞的默认状态是活的，这意味着当需要清除时没有主动暴露于控制分子的任何细胞将继续存在。从患者完全清除将需要100％的治疗细胞与适当浓度的控制分子接触，这在实践中难以实现。在细菌治疗的背景下这种特别成问题，其中脱落的速率很高，并且人对人的传播是可能的。

毒素依赖性生物封存方法的第二个缺点是细胞发生逃逸的高频率，因为使毒素基因失能的任何突变(例如无义突变、转座子插入等)将破坏该生物封存策略。为了降低逃逸速率，可以编码毒素的多个拷贝，从而需要多个突变才能逃逸，这将比单个突变更低频。尽管这种冗余确实成功地降低逃逸速率(Cai et al.,(2015)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.112,1803–1808；Chan et al.,(2015)Nat.Chem.Biol.12,82–86；Gallagher et al.,(2015)Nucleic Acids Res.43,1945–1954)，可移动的遗传元件在非模型生物体中是常见的，并且一旦被诱导复制，就能够高频率插入多个位置。其中功能丧失突变将破坏生物封存的任何策略，包括依赖于毒素的所有策略，都存在这种基本限制。

作为使用毒素的替代方案，有人描述了将控制分子的存在与必需基因的表达相联系的策略，其中在不存在控制分子的情况下，不产生所述必需基因，细胞不再存活。该策略避免了有关菌株脱落的困扰，因为细胞的默认状态是死亡，它们必须被主动地供应控制分子才能保持存活。

另外，与毒素相比，对必需基因的使其无功能的突变将导致活力损失，而不是从生物封存中逃逸。然而，对于迄今为止所描述的许多诱导型活力策略，生物封存依赖于在没有控制分子的情况下阻断表达的转录阻遏子。与基于毒素的策略一样，基于阻遏子的生物封存可以容易地受到功能丧失突变的影响，防止阻抑子发挥功能并且因此产生必需基因的组成表达。

因此，在本领域中需要减少或消除逃逸频率的新的生物封存策略。

发明内容

本公开部分地涉及使用激活子来激活用于重组细菌的生物封存的必需基因表达。如上面所讨论的，阻遏子能够通过防止阻遏子发挥功能、从而引起必需基因的组成表达的功能丧失突变所破坏，与之相比，对激活子的最常见突变将导致在任何条件下没有必需基因的表达，因此将更不容易逃逸。