[发明专利]编码CRISPR蛋白的合成的自复制RNA载体及其用途

说明书

提供编码CRISPR蛋白的合成的、非感染性的自复制RNA载体。各种自复制RNA载体包含编码来自α病毒的多种非结构性复制复合体蛋白的序列和编码CRISPR蛋白的序列。还提供用于基因组编辑的方法，其中合成的自复制RNA载体连同至少一种对应的向导RNA一起转染至细胞中。

相关申请

本申请要求美国临时专利申请号62/847,032(提交日期2019年5月13日)的优先权权益，所述申请的完整内容以其整体并入本文。

序列表

此申请包含序列表，其已以ASCII格式经EFS-Web提交，并在此通过引用以其整体并入。创建于2020年5月13日的ASCII副本被命名为P19-084_WO-PCT_SL.txt，且其大小为77,524字节。

领域

本公开涉及编码CRISPR蛋白的合成的自复制RNA载体，其中该合成的自复制RNA载体可连同对应的向导RNA一起转染至细胞中，用于基因组编辑方法。

背景

作为基因组编辑工具的成簇规律间隔短回文重复(CRISPR)和CRISPR-相关(Cas)CRISPR/Cas系统的近期发展已为改造用于真核基因组修饰的位点特异性内切核酸酶提供了前所未有的容易和简单。已开发许多递送系统以将CRISPR递送至真核细胞。然而，慢病毒、逆转录病毒和质粒系统携有将CRISPR编码序列整合至宿主细胞基因组中的风险。因此，存在对提供CRISPR蛋白稳健表达并避免基因组整合风险的CRISPR基因递送系统的需要。

概述

在本公开各种方面中，提供编码CRISPR蛋白的自复制RNA载体。

本公开的一个方面提供自复制RNA载体，其包含编码来自α病毒的多种非结构性复制复合体蛋白的序列和编码CRISPR蛋白的序列。CRISPR蛋白可为II型Cas9蛋白、V型Cas12蛋白、VI型Cas13蛋白、CasX蛋白或CasY蛋白。在某些实施方案中，CRISPR蛋白可为酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes) Cas9、新凶手弗朗西斯氏菌(Francisella novicida)Cas9、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) Cas9、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus) Cas9、巴氏链球菌(Streptococcus pasteurianus) Cas9、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni) Cas9、脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitis) Cas9、灰色奈瑟菌(Neisseria cinerea) Cas9、新凶手弗朗西斯氏菌Cas12、氨基酸球菌属物种(Acidaminococcus sp.) Cas12、毛螺菌科细菌(Lachnospiraceae bacterium) ND2006Cas12、韦德纤毛菌(Leptotrichia wadei) Cas13a、沙氏纤毛菌(Leptotrichia shahii)Cas13a、普雷沃氏菌属物种(Prevotella sp.) P5-125 Cas13或生黄瘤胃球菌(Ruminococcus flavefaciens) Cas13d。在特定迭代中，CRISPR蛋白为酿脓链球菌Cas9或金黄色葡萄球菌Cas9。