[发明专利]编码CRISPR蛋白的合成的自复制RNA载体及其用途

权利要求书

1.自复制RNA载体，其包含编码来自α病毒的多种非结构性复制复合体蛋白的序列和编码CRISPR蛋白的序列。

2.权利要求1的自复制RNA载体，其中所述CRISPR蛋白为II型Cas9蛋白、V型Cas12蛋白、VI型Cas13蛋白、CasX蛋白或CasY蛋白。

3.权利要求1或2的自复制RNA载体，其中所述CRISPR蛋白为酿脓链球菌Cas9、新凶手弗朗西斯氏菌Cas9、金黄色葡萄球菌Cas9、嗜热链球菌Cas9、巴氏链球菌Cas9、空肠弯曲杆菌Cas9、脑膜炎奈瑟菌Cas9、灰色奈瑟菌Cas9、新凶手弗朗西斯氏菌Cas12、氨基酸球菌属物种Cas12、毛螺菌科细菌ND2006 Cas12、韦德纤毛菌Cas13a、沙氏纤毛菌Cas13a、普雷沃氏菌属物种P5-125 Cas13或生黄瘤胃球菌Cas13d。

4.权利要求3的自复制RNA载体，其中所述CRISPR蛋白为酿脓链球菌Cas9或金黄色葡萄球菌Cas9。

5.权利要求1至4中任意一项的自复制RNA载体，其中编码所述CRISPR蛋白的序列包含至少一个核苷酸插入、缺失和/或替换，致使所述CRISPR蛋白具有改变的催化活性、改善的靶位点特异性和/或减少的脱靶效应。

6.权利要求1至5中任意一项的自复制RNA载体，其中所述CRISPR蛋白为核酸酶、切口酶或不具有裂解活性。

7.权利要求1至6中任意一项的自复制RNA载体，其中所述CRISPR蛋白连接于至少一种核定位信号。

8.权利要求1至7中任意一项的自复制RNA载体，其中所述CRISPR蛋白连接于至少一种荧光蛋白、至少一种染色质调控基序、至少一种功能性结构域或其组合。

9.权利要求8的自复制RNA载体，其中所述至少一种功能性结构域为表观遗传修饰结构域、转录激活结构域或转录阻遏物结构域。

10.权利要求1至9中任意一项的自复制RNA载体，其中编码所述CRISPR蛋白的序列是为了在人类细胞中表达而密码子优化的。

11.权利要求1至10中任意一项的自复制RNA载体，其中所述α病毒为奥拉病毒、巴班肯病毒、巴马森林病毒、贝巴鲁病毒、博吉河病毒、基孔肯雅病毒、东方马脑炎病毒、沼泽地病毒、摩根堡病毒、格塔病毒、高地J病毒、克泽拉格齐病毒、马亚罗病毒、米德尔堡病毒、穆坎布病毒、恩杜茂病毒、皮克孙纳病毒、奥绒绒病毒、罗斯河病毒、鹭山病毒、塞姆利基森林病毒、辛德比斯病毒、乌纳病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、西方马脑炎病毒或沃达罗河病毒。

12.权利要求11的自复制RNA载体，其中所述α病毒为委内瑞拉马脑炎病毒。

13.权利要求1至12中任意一项的自复制RNA载体，其中所述载体进一步包含编码至少一种选择性标记的序列。

14.权利要求1至13中任意一项的自复制RNA载体，其中所述载体进一步包含编码E3L蛋白的序列。

15.权利要求1至14中任意一项的自复制RNA载体，其中所述载体基于修饰的委内瑞拉马脑炎(VEE)病毒并从5’至3’包含：5’帽、5’ UTR；编码所述多种非结构性复制复合体蛋白的序列，其编码来自VEE病毒的四种非结构性复制复合体蛋白；启动子、编码所述CRISPR蛋白的序列、任选的IRES、任选的编码E3L蛋白的序列、任选的IRES、任选的编码选择性标记的序列、α病毒3’ UTR和多聚A尾。