[发明专利]用于寡核苷酸的脱保护的方法

说明书

本发明涉及一种用于寡核苷酸的纯化的新方法，所述方法包括通过用酸进行柱上脱保护来去除寡核苷酸的5'‑O‑寡核苷酸末端处的酸不稳定的5'羟基保护基团。

本发明涉及一种用于寡核苷酸的纯化的新方法，该方法包括通过用酸进行柱上脱保护来去除寡核苷酸的5'-O-寡核苷酸末端处的酸不稳定的5'羟基保护基团。

通常通过固相合成制备的寡核苷酸在其从固体支持物上切割后仍含有大量杂质。对于长度为15到20-mer的标准单体，API纯度最好在70％到80％的范围内。对于经化学修饰的单体或更长的序列，API含量通常甚至更低。

已经开发了选择性分离方法来制备满足治疗应用规范的高纯度寡核苷酸。

在一种方法中，寡核苷酸在从固体支持物上切割后，在5'-O-寡核苷酸末端处留下酸不稳定的5'羟基保护基团。该基团的疏水性允许应用有效的色谱技术进行纯化。

粗制寡核苷酸通过以下步骤是常见的策略(例如Krotz等人，Organic ProcessResearchDevelopment 2003,7,47-52)：

a)反相色谱

b)浓缩和脱盐

c)在溶液中去除酸不稳定的5'羟基保护基团，和

d)进一步浓缩和脱盐

已发现，由于单个操作步骤a)至d)的数量，该已知方法需要大量操作时间。

本发明的目的是减少纯化步骤的数量并由此减少操作时间，并且还试图达到更高的总产率。

据发现，本发明的目的可以通过如上概述的用于寡核苷酸的纯化的新方法来达到。

阐述以下定义以说明和定义用于描述本发明的各种术语的含义和范围。

术语酸不稳定的5'羟基保护基团被定义为在合适的酸的帮助下可切割并具有疏水特性的保护基团。

典型的酸不稳定的5'羟基保护基团选自4,4'-二甲氧基三苯甲基、4-甲氧基三苯甲基、三苯甲基、9-苯基-呫吨-9-、9-(对甲苯基)-呫吨-9-基或选自叔丁基二甲基甲硅烷基，优选地选自4,4'-二甲氧基三苯甲基、4-甲氧基三苯甲基或三苯甲基，或者甚至更优选地选自4,4'-二甲氧基三苯甲基。

如本文所用，术语“寡核苷酸”如本领域技术人员通常理解的那样被定义为包含两个或更多个共价连接的核苷酸的分子。为了用作具有治疗价值的寡核苷酸，通常合成含有长度为10个至40个核苷酸，优选地是10个至25个核苷酸的寡核苷酸。

寡核苷酸可由任选经修饰的DNA、RNA或LNA核苷单体或其组合组成。

LNA核苷单体是经修饰的核苷，其在核苷酸的核糖环的C2'与C4'之间包含连接基基团或桥。这些核苷在文献中也称为桥连核酸或双环核酸(BNA)。

任选地，如本文所用的经修饰的是指与等同的DNA、RNA或LNA核苷相比，通过引入糖部分或核碱基部分的一个或多个(一种或多种)修饰而被修饰的核苷。在一个优选的实施例中，经修饰的核苷包含经修饰的糖部分，并且可以例如包含一个或多个2’取代的核苷和/或一个或多个LNA核苷。术语经修饰的核苷在本文中还可与术语“核苷类似物”或经修饰的“单元”或经修饰的“单体”互换地使用。

DNA、RNA或LNA核苷通常通过磷酸二酯(P＝O)和/或硫代磷酸酯(P＝S)核苷间键连接，该键将两个核苷共价偶联在一起。

因此，在一些寡核苷酸中，所有核苷间键都可以由磷酸二酯(P＝O)组成，在其他寡核苷酸中，所有核苷间键都可以由硫代磷酸酯(P＝S)组成，或者在又其他寡核苷酸中，核苷间键的序列不同并且包含磷酸二酯(P＝O)和硫代磷酸酯(P＝S)核苷间键两者。