[发明专利]一种联合A群链球菌制剂和TLR8激动剂共刺激扩增CIK细胞的方法及其应用

说明书

本发明公开了一种联合A群链球菌制剂和TLR8激动剂共刺激扩增CIK细胞的方法及其应用，属于细胞培养技术领域。所述的联合A群链球菌制剂和TLR8激动剂共刺激扩增CIK细胞的方法，通过A群链球菌制剂和TLR8激动剂的组合来刺激扩增CIK细胞。本发明所述方法培养的CIK细胞与常规方法培养制备的CIK细胞相比，利用A群链球菌制剂和TLR8激动剂作为刺激剂，直接激活CIK细胞，使获得的CIK细胞具有数量大、纯度高、细胞毒性强等特点，从而能够满足临床的需要。

技术领域

本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种联合A群链球菌制剂和TLR8激动剂共刺激扩增CIK细胞的方法及其应用。

背景技术

细胞因子诱导的杀伤细胞(Cytokine induced killer cell，CIK)，是将单个核细胞经多种细胞因子共同培养刺激后所获得的一群异质细胞，其同时表达CD3和CD56两种膜蛋白分子，兼具T淋巴细胞强大的抗瘤活性和非主要组织相容性复合物(MHC)限制性杀瘤的优点。制备CIK使用的种子细胞来源包括外周血、脐带血等，CIK细胞具有增殖速度快、杀瘤活性高、杀瘤谱广、对多重耐药肿瘤细胞同样敏感、对正常骨髓造血前体细胞细胞毒性小等特点，是目前发现的杀伤肿瘤细胞活性强，适合于临床应用的一种理想的效应细胞。

A群链球菌制剂为白色粉末，加生理氯化钠溶液溶解后呈白色混浊液体，经试验证明具有直接杀伤肿瘤细胞，激活宿主细胞免疫的功能，并可提高T细胞和NK细胞活性；与化疗合用可提高疗效并可能有减轻化疗药对骨髓抑制的作用，可调节T细胞亚群使T3、T4、及T4/T8比值全面上升。

曾刚等人报道了A群链球菌制剂抗肿瘤效应与细胞因子的关系，结果表明，A群链球菌制剂与肿瘤患者外周血淋巴细胞(PBL)共同孵育后，可增强PBL杀伤肿瘤细胞的能力，其上清液中亦均能检测到较高水平的IL-12、IL-2、IFN-γ和TNF-α。

陈艳媛等人报道了TLR7激动剂增强人CIK细胞杀伤功能的研究，结果表明，TLR7激动剂(Tlr7a)具有增强CIK效应细胞的扩增能力，其刺激后获得的CIK细胞对K562肿瘤细胞的杀伤效果更好。

李旺等人报道了TLR7激动剂替代IFN－γ诱导CIK细胞杀伤肿瘤的研究，结果表明，TLR7α通过刺激免疫细胞分泌多种免疫细胞因子及趋化因子，如IL-1、IL-6、IL-8、IL-12、IL-18、TNF-γ等，引发抗原呈递细胞上的MNC分子和共刺激信号上调以及激活CIK，扩大免疫效应。

专利CN104928241B公开了添加人CD3抗体和TLR7/8激动剂体外活化扩增的NK细胞的生物制剂，可在不与K562等肿瘤细胞混合的情况下安全且简单有效地使NK细胞活化并增殖。

目前常用的技术主要是在体外培养体系中加入IL-2、IL-15、IFN-γ等多种细胞因子组合来促进CIK细胞的扩增，但经过一段时间后扩增倍数和纯度亦不够理想，且杀伤活性亦不理想，导致不能完全满足实际应用的需求；而且这些已知方法由于对细胞因子的需求量较大、成本较高，培养效果不稳定，不适合大规模的应用。因此，亟需一种能够显著提高CIK细胞的免疫细胞活性和增殖能力的方法。

发明内容

为了克服上述现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种联合A群链球菌制剂和TLR8激动剂共刺激扩增CIK细胞的方法。

本发明的第二个目的在于提供联合A群链球菌制剂和TLR8激动剂共刺激扩增CIK细胞的方法的应用。

本发明目的通过以下技术方案实现：

一种联合A群链球菌制剂和TLR8激动剂共刺激扩增CIK细胞的方法，通过A群链球菌制剂和TLR8激动剂的组合来刺激扩增CIK细胞。

上述联合A群链球菌制剂和TLR8激动剂共刺激扩增CIK细胞的方法，包括如下步骤：

(1)采集血液，分离获得单个核细胞；