[发明专利]二重荧光LAMP区分网状内皮增生症病毒和J亚群禽白血病病毒检测试剂盒及其引物组

说明书

本发明公开了二重荧光LAMP区分网状内皮增生症病毒和J亚群禽白血病病毒检测引物组，包括引物1至引物14，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.14的碱基序列，其中引物7为与引物1互补的探针、引物14为与引物8互补的探针，它们使扩增反应具有很高特异性，能分别与REV gp90基因和ALV‑J gp85基因结合，反应后在不同波长荧光下发出不同颜色荧光，从而实现快速敏感特异地鉴别REV和ALV‑J。据此，还研制了相应试剂盒并建立相应LAMP方法。总之，本发明特异性强、灵敏度高、快速简的特点，适合在基层兽医站和具备基本实验仪器的养殖场中进行快速检测，具有较好的应用前景。

技术领域

本发明属于病毒检测技术领域，尤其涉及一种二重荧光LAMP区分网状内皮增生症病毒和J亚群禽白血病病毒检测试剂盒及其引物组。

背景技术

网状内皮增生症(reticuloendotheliosis,RE)是由网状内皮增生症病毒(reticuloendotheliosis virus，REV)感染禽类的致肿瘤的传染病。禽白血病(AvianLeukosis,AL)是由禽白血病病毒(Avian Leukosis Virus,ALV)引起的感染禽类的致肿瘤的传染病，外源性ALV包含ALV-A、ALV-B、ALV-J等亚群，禽感染后可发生肿瘤，E亚群是内源性ALV不引起肿瘤。目前ALV-J的感染最广泛，造成的危害最严重。这两种病毒不仅可以感染鸡、火鸡等导致肿瘤产生，还能导致后期免疫抑制，其产生的肿瘤凭肉眼难以辨别，并且常常发生混合感染，需要通过实验室手段进行鉴别诊断。目前可以通过检测这两种病毒的基因对REV和ALV-J进行鉴别诊断。ALV不同亚群之间的囊膜蛋白基因差异较大，且ALV和REV为逆转录病毒，在感染过程中将自身RNA逆转录为cDNA插入宿主DNA中，因此检测ALV可跳过反转录步骤直接检测其插入到宿主中的DNA。

传统的检测方法需要使用昂贵的仪器和试剂等。环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplimeqication，LAMP)是由Notomi等于2000年建立的一种新型核酸扩增技术，该技术具有操作简便、反应快速、成本低廉和结果可视化等优点，在一些病原微生物的检测中已被广泛运用。在传统的LAMP检测方法中，创新性地加入一条Fd探针与F1C反向互补，分别在两条引物上标记荧光基团和淬灭基团，反应时随着LAMP扩增时的链置换作用被置换下来，探针发出荧光。

经查，国内外均未见有建立二重荧光LAMP区分网状内皮增生症病毒和J亚群禽白血病病毒可视化检测试剂盒和方法的相关报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种特异性强、灵敏度高、快速简便的二重荧光LAMP区分网状内皮增生症病毒和J亚群禽白血病病毒检测试剂盒及其引物组。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

二重荧光LAMP区分网状内皮增生症病毒和J亚群禽白血病病毒检测引物组，包括引物1至引物14，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.14的碱基序列。

引物7和引物14为探针，引物7与引物1反向互补，引物7在3’端标记5-FAM荧光基团，引物1在5’端标记淬灭基团BHQ-1，引物14与引物8反向互补，引物14在3’端标记CY5荧光基团，引物8在5’端标记淬灭基团BHQ-3。

引物1至引物14的摩尔比为8:8:1:1:4:4:4:8:8:1:1:4:4:4。

上述检测引物组在环介导等温扩增中的应用。

环介导等温扩增的条件为66℃反应60min，80℃作用5min灭活。

二重荧光LAMP区分网状内皮增生症病毒和J亚群禽白血病病毒检测试剂盒，包括引物1至引物14，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.14的碱基序列。