[发明专利]光控螺吡喃整体柱的制备及在细胞代谢物检测中的应用

说明书

光控螺吡喃整体柱的制备及在细胞代谢物检测中的应用，属于分析化学与生物化学领域。该系统包括：光控螺吡喃整体柱的制备、光控单元的搭建及高效液相色谱与质谱联用系统。将丙烯酰基螺吡喃、二甲基丙烯酸乙二醇酯(EDMA)、致孔剂按比例配成有机预聚合溶液，然后向活化及烷基化后的毛细管内注入螺吡喃预聚合溶液。在一定水浴温度下引发热聚合制备光控螺吡喃整体柱，该整体柱具有光控极性转换特性；通过将整体柱接入液质联用系统中可实现在可见光与紫外光先后照射下整体柱极性转变进而对A549细胞代谢物分离与检测，最终在可见光条件下实现对A549细胞中能量分子如ATP、ADP的检测，紫外光下三羧酸循环中间体、戊糖磷酸循环中间体的选择性检测。

技术领域

本发明涉及一种光控螺吡喃整体柱的制备及在细胞代谢物检测中的应用，属于分析化学与生物化学领域。

背景技术

代谢组学是继基因组学、转录组学与蛋白质组学后又一新兴领域，主要通过对代谢物的定性与定量分析，实现对生物体体内动态水平的监控。色谱技术因其具有较强的分离能力被广泛的用于代谢物的分离。可以根据代谢物的种类不同，可以选择不同的分离方法。通常情况下，反相液相色谱适用于分离非极性及弱极性代谢物，亲水作用色谱适用于分离极性较强的代谢物。然而到目前为止，还没有一种单一的色谱柱能够实现对样品中全极性的代谢物的分离。因此，由于分离不充分而带来的离子抑制效应将不可避免对微量代谢物的检测产生影响。

螺吡喃化合物是指一个带有SP³碳原子相连接的芳香环，通过SP³碳原子与另一个吡喃环相连接的一类具有光致变色性质的有机化合物的统称。在紫外光照射下，螺吡喃分子发生闭环体与开环体之间的可逆转变，伴随化合物极性、颜色与荧光性质发生改变。利用螺吡喃化合物的这一性质结合荧光显微镜与紫外分光光度计等仪器，可以实现含S、F等亲核性较强的代谢物的高灵敏度、高选择性检测。然而，利用螺吡喃分子制备毛细管整体柱，通过光控快速改变整体柱极性进而实现在一次进样中先后分离检测不同极性的细胞代谢物的技术尚未见报道。

发明内容

本发明制备了光控螺吡喃整体柱并用于A549细胞代谢物的检测。基于螺吡喃化合物在不同波长光照条件下，分子本身发生闭环体与开环体的可逆转变，从而对不同极性的代谢物分子进行选择性的吸附与分离。应用此系统实现在可见光下对A549细胞内能量分子如ATP、ADP等的分离检测，紫外光下实现对三羧酸循环中间体、戊糖磷酸循环中间体的选择性分离检测。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种光控螺吡喃整体柱的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

以1，4-丁二醇、异丙醇、氯仿为制孔剂，二甲基丙烯酸乙二醇酯(EDMA)、丙烯酰基螺吡喃为单体，制孔剂、单体并加入引发剂，注入到烷基化后的毛细管中并在50-70℃水浴下引发热聚合，制备光控丙烯酰基螺吡喃整体柱；

使用的丙烯酰基螺吡喃单体的合成过程如下：①取2，3，3-三甲基吲哚(1.0eq)，2-溴乙醇(1.2eq)加入到盛有无水乙腈的三颈烧瓶中，氮气保护下，回流24h，冷却至室温，旋干剩余溶剂，粗产物在乙醚：三氯甲烷体积比＝1：1的溶液中重结晶，得到粉红色固体产物1；②取产物1(1.0eq)溶于盛有超纯水的圆底烧瓶中，在冰浴条件下，加入KOH(1.6eq)，待溶液变成黄色，在室温下搅拌30min，使用乙酸乙酯进行萃取，无水硫酸钠干燥，有机相浓缩得黄色油状产物2；③取产物2(1.0eq)于盛有溶解在无水乙醇中的5-硝基水杨醛(1.3eq)的三颈烧瓶中，氮气保护下，回流4h，冷却至室温，过滤，使用乙醇清洗，干燥，得到紫红色固体产物3；④取产物3(1.0eq)于盛有二氯甲烷的三颈烧瓶中，滴加溶解在二氯甲烷中的丙烯酰氯(1.3eq)室温搅拌6h，反应结束后用水进行洗涤，收集二氯甲烷层，无水硫酸钠干燥，使用乙酸乙酯：正己烷体积比＝1：5作为流动相过柱，收集Rf值为0.7的组分。