[发明专利]光控螺吡喃整体柱的制备及在细胞代谢物检测中的应用

权利要求书

1.一种光控螺吡喃整体柱的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

以1，4-丁二醇、异丙醇、氯仿为制孔剂，二甲基丙烯酸乙二醇酯(EDMA)、丙烯酰基螺吡喃为单体，制孔剂、单体并加入引发剂，注入到内表面烷基化的毛细管中，在50-70℃水浴下引发热聚合，制备光控丙烯酰基螺吡喃整体柱。

2.按照权利要求1所述的一种光控螺吡喃整体柱的制备方法，其特征在于，

使用的丙烯酰基螺吡喃单体的合成过程如下：①取2，3，3-三甲基吲哚1.0eq、2-溴乙醇1.2eq加入到盛有无水乙腈的三颈烧瓶中，氮气保护下，回流24h，冷却至室温，旋干剩余溶剂，粗产物在乙醚：三氯甲烷体积比＝1：1的溶液中重结晶，得到粉红色固体产物1；②取产物1 1.0eq溶于盛有超纯水的圆底烧瓶中，在冰浴条件下，加入KOH1.6 eq，待溶液变成黄色，在室温下搅拌30min，使用乙酸乙酯进行萃取，无水硫酸钠干燥，有机相浓缩得黄色油状产物2；③取产物2 1.0eq于盛有溶解在无水乙醇中的5-硝基水杨醛1.3eq的三颈烧瓶中，氮气保护下，回流4h，冷却至室温，过滤，使用乙醇清洗，干燥，得到紫红色固体产物3；④取产物3 1.0eq于盛有二氯甲烷的三颈烧瓶中，滴加溶解在二氯甲烷中的丙烯酰氯1.3eq室温搅拌6h，反应结束后用水进行洗涤，收集二氯甲烷层，无水硫酸钠干燥，使用乙酸乙酯：正己烷体积比＝1：5作为流动相过柱，收集Rf值为0.7的组分。

3.按照权利要求1所述的一种光控螺吡喃整体柱的制备方法，其特征在于，整体柱制备时，其丙烯酰基螺吡喃单体与制孔剂的质量比例为1：2；EDMA与丙烯酰基螺吡喃的质量比例为1：1，其中制孔剂1，4-丁二醇，异丙醇、氯仿的质量比例为5：5：10，使用的引发剂为偶氮二异丁腈，聚合时间为5～7h。

4.按照权利要求1所述的一种光控螺吡喃整体柱的制备方法，其特征在于，使用的毛细管的规格为内径50～100μm，外径160～360μm，外表面有聚乙烯涂层。

5.按照权利要求1-3任一项所述的方法制备得到的光控螺吡喃整体柱。

6.权利要求1-3任一项所述的方法制备得到的光控螺吡喃整体柱在细胞代谢物检测中的应用。

7.按照权利要求6的应用，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一、细胞代谢物样品的制备：将培养A549细胞的6孔板置于冰上，加入萃取溶剂后移至冰箱-20℃放置5min对细胞内的代谢物进行萃取，使用细胞刮刀将细胞从壁上刮下，转移细胞悬浮液至离心管中，离心，收集上层清液于离心管中待用；

步骤二、细胞代谢物的可见光分离检测：将制备的光控螺吡喃整体柱，搭建高效液相色谱质谱系统，利用光控螺吡喃整体柱在可见光照射300s后进行可见光下A 549细胞代谢物的分离与检测；

步骤三、细胞代谢物的紫外光分离检测：对进行过步骤二的光控螺吡喃整体柱进行紫外光照240s后，进行A 549细胞代谢物的分离与检测。

8.按照权利要求6的应用，其特征在于，步骤一中A 549细胞接种于6孔板时，细胞密度为3×10⁵/孔；

步骤一中接种后的细胞要在37℃，CO₂含量为5％的培养箱中培养48h。

步骤一中进行A549细胞萃取时，萃取溶剂为异丙醇。

9.按照权利要求6的应用，其特征在于，步骤二与步骤三中，使用的光控螺吡喃整体柱与液质联用系统联用：包括进样系统、压力系统、分离系统与检测系统4部分组成；将盛有代谢物的进样瓶置于4℃的样品台上，进样体积为1μL，在流动相的驱动下将样品引入光控螺吡喃整体柱中进行代谢物的分离，在整体柱出口端连接弹性石英毛细管等内径喷针，实现纳升流速样品的电喷雾电离，在质谱正离子模式下进行检测；

使用的流动相为体积比为1:1的甲醇/水溶液，中使用的流速为0.15μL/min。

10.按照权利要求6的应用，其特征在于，步骤二中的可见光采用白炽灯，步骤三中的紫外光采用365nm紫外灯；采用双光源对向辐照设计，保证整体柱全方位均匀受光；

在可见光下对A549细胞内能量分子如ATP、ADP等的分离检测，紫外光下实现对三羧酸循环中间体、戊糖磷酸循环中间体的选择性分离检测。