[发明专利]检测百合病毒的多重PCR引物及其在免RNA提取的百合病毒快速检测方法中的应用

说明书

本发明公开了检测百合病毒的多重PCR引物，所述百合病毒分别为黄瓜花叶病毒CMV、百合无症状病毒LSV和百合斑驳病毒LMoV；同时还给出了其在免RNA提取的百合病毒快速检测方法中的应用。本发明的优点首先在于简化了RNA提取方法，采用解剖针挑取百合微量皮下组织迅速转移至逆转录反应液，取样方法简便易操作，省去了可引起RNA降解和污染的中间环节，无需RNA提取试剂盒，降低了检测成本，提高了工作效率；其次，自主设计开发百合病毒CMV、LSV、LMoV引物并筛选出PCR产物电泳条带清晰、重复性好的特异性引物3对，回收扩增片段测序，序列比对同源性达到98％以上，证明本方法设计开发的引物扩增得到的基因片段确为百合CMV、LSV和LMoV，保证检测结果真实可靠。

技术领域

本发明涉及病毒检测技术领域，具体涉及检测百合病毒的多重PCR引物及其在免RNA提取的百合病毒快速检测方法中的应用。

背景技术

兰州百合是我国百合品种中唯一的甜百合，是兰州市最具特色的名优特农产品之一。近年来兰州百合种植规模不断扩大，但生产用百合种球繁殖通过籽球、鳞片扦插等方式进行,长期的无性繁殖极易造成病毒病害的传播和积累,导致百合产量降低、品质变劣和价格大幅度波动等，严重制约了兰州百合产业化发展。据调查，危害兰州百合的主要病毒有黄瓜花叶病毒(CMV)、百合无症状病毒(LSV)、百合斑驳病毒(LMoV)。目前，控制百合病毒病的有效途径是生产和推广种植脱毒种球，而准确、高效的病毒检测技术是百合脱毒种球生产环节中必不可少的关键技术。

植物病毒检测方法有多种，其中RT-PCR技术因特异性强、灵敏度高等优点，近年来在百合病毒检测方面得到了一定的应用。但由于RT-PCR检测技术相关试剂成本高、技术难度大、实验条件严格，限制了该项技术的普及和应用。同时，申请人研究团队曾借用前人研发的技术成果用于兰州百合病毒检测研究，但发现其中出现重复性差、非特异性扩增或者无扩增、结果无法辨识等问题。因此，改良百合RT-PCR病毒检测方法，研发快速高效、稳定可靠的百合病毒检测技术具有重要的现实意义。

快速、高效的病毒检测技术在百合脱毒种球生产和推广应用中具有重要意义。采用RT-PCR技术进行植物病毒检测，影响检测效果的首要关键因素是RNA提取质量。通常，植物组织RNA分离存在“三高”问题，即提取试剂费用高、操作技术难度高、实验条件要求高等，RNA提取专用试剂盒费用高且方法步骤繁琐，费时费力，30个样本检测3种病毒的时间需要2-3个工作日；其次，提取RNA对实验室条件和操作人员技术要求极为严格，无处不在的RNase随时会降解RNA，导致RNA提取失败或质量太差，无法满足实验要求；另外，百合病毒特异性引物序列对PCR扩增至关重要，目前关于兰州百合病毒检测有一些报道，但直接应用前人研究成果达不到预期效果。

发明内容

本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了检测百合病毒的多重PCR引物及其在免RNA提取的百合病毒快速检测方法中的应用，其是针对影响兰州百合病毒检测的关键因素，重点探索百合RNA提取方法和百合病毒特异性引物开发，省去可引起RNA降解和污染的中间环节，简化RNA获取方法，自主设计开发引物，通过反复试验和体系优化，研发出简便易操作、快速高效、低成本百合病毒检测方法，以便于满足科研及农业生产需要。

为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：检测百合病毒的多重PCR引物，所述百合病毒分别为黄瓜花叶病毒CMV、百合无症状病毒LSV和百合斑驳病毒LMoV，所述用于检测黄瓜花叶病毒CMV的引物对为：CMV-F如SEQ ID NO.1所示，CMV-R如SEQ ID NO.2所示；用于检测百合无症状状病毒LSV的引物对为：LSV-F如SEQ ID NO.3所示，LSV-R如SEQ IDNO.4所示；用于检测百合斑驳病毒LMoV的引物对为：LMoV-F如SEQ ID NO.5所示，LMoVR如SEQ ID NO.6所示。

本发明的第二个目的是提供了上述检测百合病毒的多重PCR引物在免RNA提取的百合病毒快速检测方法中的应用。

进一步的，上述的应用，所述免RNA提取的百合病毒快速检测方法，包括以下步骤：