[发明专利]茴香霉素的制备方法、茴香霉素的检测方法及抑菌应用

说明书

本发明公开了一种茴香霉素的制备方法、茴香霉素的检测方法及抑菌应用，该茴香霉素的制备方法，包括：取小白链霉菌CK‑15的菌株种子液接种于种子培养基，28℃、220rpm培养24h后，按照5％接种量转接至100ml发酵培养基中，30℃发酵5d，将得到的发酵液经离心处理，收集第一上清液；将第一上清液的pH调至9.0，用与上清液等体积的乙酸乙酯萃取第一有机相；用与第一有机相等体积的pH为2.0的酸水对第一有机相反向萃取，收集水相并将水相的pH调至9.0；用与水相等体积的乙酸乙酯萃取，收集第二有机相并旋干。本发明的茴香霉素的制备方法，通过小白链霉菌CK‑15菌株进行发酵制备茴香霉素，相比于采用化学合成方法制备茴香霉素，该制备方法简单，方便操作，成本较低。

技术领域

本发明涉及微生物发酵技术领域，尤其一种通过发酵来制备茴香霉素的方法、茴香霉素的检测方法及抑菌应用。

背景技术

茴香霉素(Anisomycin)是由浅灰链霉(Streptomycesgriseus)等放线菌产生的一种含氮杂环类芳香族抗生素，具有很好的抗真菌、抗原虫和和抗肿瘤作用。目前广泛应用于细胞与分子遗传学领域研究，同时具有作为免疫抑制药物开发的巨大潜力。

目前制备茴香霉素大都采用化学合成的方法，采用化学合成的方法制备茴香霉素存在手性催化剂成本昂贵、反应条件苛刻、对映体分离困难、环境污染严重等诸多的难题。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的第一目的在于提供一种茴香霉素的制备方法。

为实现上述目的，本发明茴香霉素的制备方法技术方案如下：

一种茴香霉素的制备方法，包括：

取小白链霉菌CK-15(Streptomyces albulus strain CK-15)的菌株种子液接种于种子培养基，28℃、220rpm培养24h后，按照5％接种量转接至100ml发酵培养基中，30℃发酵5d，将得到的发酵液经离心处理，收集第一上清液；

将所述第一上清液的pH调至9.0，用与所述上清液等体积的乙酸乙酯萃取第一有机相；

用与所述第一有机相等体积的pH为2.0的酸水对所述第一有机相反向萃取，收集水相并将所述水相的pH调至9.0；

用与所述水相等体积的乙酸乙酯萃取，收集第二有机相并旋干。

进一步，所述方法还包括：

将所述第二有机相通过大孔吸附树脂HP-20预处理，依次通过ODS、Sephadex LH-20层析，采用乙酸乙酯与甲醇比例从20:1到1:20进行梯度洗脱，去所述第二有机相中的杂质，获得茴香霉素粗品；

将所述茴香霉素粗品用甲醇溶解，经滤膜过滤后，采用高效液相色谱法(HighPerformance Liquid Chromatography,HPLC)，收集茴香霉素出现峰值时的液相，将所述液相在60℃以下减压浓缩干燥，冷冻干燥后得到淡黄色的茴香霉素粉末。

进一步，所述种子培养基采用2g葡萄糖、0.6g蛋白胨、0.6g酵母粉、1g的NaCl和100ml蒸馏水混合而成，并在121℃下灭菌30min。

进一步，所述发酵培养基采用10g玉米粉、20g可溶性淀粉、10g黄豆饼粉、0.2g的KH₂PO₄、3g的NaCl、3g的NH₄Cl、4g的CaCO₃、1L的蒸馏水混合而成，且pH＝7.0。

进一步，所述菌株种子液的制备方法为：切取1cm×1cm菌块，接种于所述种子培养基中，在28℃、220rpm培养24h，获得种子液。