[发明专利]CRISPR系统及其在构建SCN1A基因突变的癫痫性脑病克隆猪核供体细胞中的应用

说明书

本发明公开了一种CRISPR/Cas9系统及其在构建SCN1A基因突变的克隆猪核供体细胞中的应用。一种用于猪SCN1A基因编辑的CRISPR/Cas9系统，包含序列如SEQ ID NO.2所示的Cas9高效表达载体pKG‑GE3和针对猪SCN1A基因的gRNA表达载体，该载体以序列如SEQ ID NO.3所示的pKG‑U6gRNA为载体骨架，表达序列如SEQ ID NO.36所示的gRNA。采用本发明筛选的gRNA联合改造的Cas9高效表达载体进行基因编辑,编辑效率比原载体有了显著的提高。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及用于SCN1A基因编辑的CRISPR/Cas9系统及其应用。

背景技术

癫痫(Epilepsy)即俗称的“羊角风”或“羊癫风”，是大脑神经元突发性异常放电导致短暂的大脑功能障碍的一种慢性疾病。由于异常放电的起始部位和传递方式的不同，癫痫发作的临床表现复杂多样，可表现为发作性运动、感觉、自主神经、意识及精神障碍等症状。癫痫患者经过正规的抗癫痫药物治疗，约70％的患者其发作是可以得到控制的，其中50％～60％的患者经2～5年的治疗可以痊愈，患者可以和正常人一样地工作和生活。癫痫的发病机制非常复杂，中枢神经系统兴奋与抑制间的不平衡导致癫痫发作，其主要与离子通道神经递质及神经胶质细胞的改变有关。

癫痫性脑病(Epileptic encephalopathies，EEs)是癫痫性异常导致进展性脑部功能障碍，是一种儿童期常见的脑部疾病，以多种严重的癫痫症候群为特征的神经系统功能紊乱性疾病。EEs是发生在婴儿和儿童的严重痉挛性疾病，首次发病多见儿童、青年时期，男性高于女性，儿童死亡率是成人的10倍，然而病因、发病机制仍不十分明确，年龄依赖性是EEs的共同特征，早发性癫痫性脑病(Early-onset epileptic encephalopathies，EOEE)包括早发性肌阵挛脑病(Early myoclonic epileptic encephalopathy，EMEE)、大田原综合征(Ohtahara syndrome，OS)、婴儿恶性游走性部分性癫痫(Malignant migratingpartial seizures in infancy，MMPSI)、West综合征及Dravet综合征。

Dravet综合征，以前称为严重的婴儿肌阵挛性癫痫(Severe myoclonic epilepsyof infancy，SMEI)，由Dravet在1978年首次描述，患儿均于1岁内起病，起病高峰年龄为生后6个月内。最常见的首发症状为发热诱发的较长时间惊厥发作(30分钟以上)，表现为单侧肢体阵挛或双侧强直阵挛发作，部分患儿首次发作前有接种疫苗诱因。1岁后逐渐出现无热惊厥，但仍有热敏感特点(遇到发热性疾病或环境温度过热即可出现癫痫发作)，癫痫发作可以表现为多种形式，包括局灶性发作、全面强直阵挛发作(癫痫大发作)、肌阵挛发作、不典型失神发作等，易出现癫痫持续状态。患儿起病前发育多正常，发病后通常会经历语言和运动技能发展滞后、多动症和睡眠困难、慢性感染、生长和平衡问题以及与他人相处困难等问题，60％患儿有共济失调表现，且不会随着时间的推移而消失，被诊断为Dravet综合征的儿童需要有极大耐心和密切关注他们生活的看护人。在以后的生活中，Dravet综合征患者会出现无症状的癫痫发作，包括肌阵挛性发作、强直性-阵挛性发作、失神、简单和复杂的局部发作。在70％的Dravet综合征患者中发现了SCN1A基因突变，该基因编码神经元电压门控钠离子通道Na(V)1.1α亚基蛋白(电压门控钠离子通道是可兴奋细胞中动作电位产生和传导所必需的一个离子通道，主要发生在神经和肌肉)，特异性定位于神经元胞体。因此，本发明基于SCN1A基因突变开发了克隆猪核移植供体细胞，后期通过体细胞核移植动物克隆技术培育出活体猪模型，可用于进行Dravet综合征发病机制研究，并为相关药物的开发及临床应用提供有效的实验数据，也为成功治疗人类相关疾病奠定基础。