[发明专利]结合高压分子动力学模拟、自由能计算改善水解酶鲁棒性

说明书

本发明公开了结合高压分子动力学模拟、自由能计算改善水解酶鲁棒性，属于计算化学、生物信息学、基因工程以及蛋白质工程领域。本发明方法先通过高压扰动结合分子动力学模型模拟计算，寻找强鲁棒性相关区域和关键氨基酸位点，再对关键区域上的氨基酸进行虚拟饱和突变，构建突变体库，然后通过用多尺度自由能计算软件从蛋白质动力学、蛋白质热力学、预测算法上对上述突变体进行稳定性预测，经多轮虚拟选择尽可能排除假阳性突变体。利用上述方法构建筛选水解酶突变体，阳性突变体频率高达62.5％，有效降低筛选工作量，获得的突变体鲁棒性强，具有很高的工业应用潜力。

技术领域

本发明涉及计算化学，生物信息学，基因工程以及蛋白质工程领域，涉及结合高压分子动力学模拟、自由能计算改善水解酶鲁棒性，具体涉及一种基于高压分子动力学模拟结合自由能计算筛选提高水解酶鲁棒性的方法。

背景技术

水解酶(EC 3，Hydrolase)是催化水解反应的一类酶的总称，包括脂肪酶、酯酶、蛋白酶等，能够催化各类反应，如酯交换反应、酯化反应和转酯化反应等。因良好的催化性能，水解酶在食品、医药、油脂生产加工、日用品及化妆品等工业领域均得到了广泛的应用。然而，实际的工业生产条件是极为苛刻且复杂的，水解酶需要经常暴露于高温、高压、有机溶剂、金属离子、极端pH等条件下。因此，为应对严苛的环境条件，水解酶需要具有良好的鲁棒性，水解酶的鲁棒性是指水解酶在受到环境变化等不确定因素的干扰时，依然能够保持催化特性稳定的一种特性，例如同时拥有高的热稳定性和催化活性。然而，由于酶的催化活性和稳定性之间会存在某种平衡(Trade-off)(酶的催化活性与稳定性之间呈负相关)，水解酶的鲁棒性是比较差的。

Shi等对NTU 03脂肪酶盖子区域的第189号天冬氨酸残基进行突变后导致该酶的酶催化活性升高，但是热稳定性下降(Shih T W,Pan T M.Substitution of Asp189residue alters the activity and thermostability of Geobacillus sp.NTU03lipase[J].Biotechnology Letters,2011,33(9):1841-1846.)。但也有少数关于酶稳定性与催化活性同时得到改善的相关报道。例如，Wong等人通过同源建模和分子对接的方法对来源于Trigonopsis variabilis的D-氨基酸氧化酶进行改造，使突变体Phe54Tyr的热稳定性以及活性同时提高(Kamal M Z,Ahmad S,Molugu T R,et al.In vitro evolved non-aggregating and thermostable lipase:structural and thermodynamicinvestigation[J].J Mol Biol,2011,413(3):726-741.)。可见，尽管传统改造手段能获得少数鲁棒性增强的突变体，但是，由于鲁棒性改善的具体机制尚不清晰，改造的盲目性比较大。酶的鲁棒性进化依旧是一个棘手的问题。

目前，对酶的催化特性的改造主要分为定向进化、半理性设计和理性设计，其中，定向进化的工作量大、耗时耗力(例如，一株热稳定性好的产乙酰辅酶A氧化酶基因工程菌株及其构建方法和应用，CN106520713A)，理性设计虽然大大减少了实验工作，但成功率并不乐观(例如，一种N端替换提高米曲霉木聚糖酶(AoXyn11A)热稳定性的方法，CN104388412A)。酶的催化特性改造的难点之一是选择出与水解酶功能密切相关的关键区域，半理性设计基于现有知识的基础对目标蛋白进行再设计，能够快速高效地选出关键区域。同时，半理性设计既弥补了定向进化的耗时耗力的缺点，又弥补了理性设计的低成功率。