[发明专利]结合高压分子动力学模拟、自由能计算改善水解酶鲁棒性

权利要求书

1.一种筛选鲁棒性提高的水解酶的方法，其特征在于，先结合高压扰动与分子动力学模型模拟筛选出与水解酶功能密切相关的关键区域，然后对关键区域的氨基酸进行虚拟饱和突变，通过多尺度自由能计算软件对上述突变体进行稳定性预测，筛选出强鲁棒性的突变体。

2.根据权利要求1所述的一种筛选鲁棒性提高的水解酶的方法，其特征在于，步骤包括：

步骤(1)结合高压扰动与分子动力学模型模拟筛选出与水解酶功能密切相关的关键区域，

步骤(2)对步骤(1)筛选得到的关键区域上的氨基酸进行虚拟饱和突变，

步骤(3)分别使用FoldX、I-mutant 2.0、STRUM、DynaMut、PoPMuSiC对上述虚拟突变体进行多尺度自由能计算以稳定性预测，选择上述软件预测结果中的阳性突变体的交集，进行验证实验；

步骤(4)将步骤(3)得到的交集中的突变体利用基因工程菌进行表达，并分析表征酶学性质。

3.根据权利要求2所述的一种筛选鲁棒性提高的水解酶的方法，其特征在于，步骤(1)

以水解酶的晶体结构为初始模型，在0-20000Bar压力范围下分别进行分子动力学模拟或者蒙特卡罗模拟，通过计算分析B-Factor、均方根偏差、回旋半径和均方根波动的变化趋势，确定与水解酶功能密切相关的关键区域；所述关键区域是B-factor、均方根偏差和均方根波动值最高的氨基酸残基所在区域；

能够用于所述分子动力学模拟的工具包括Gromacs、AMBER和NAMD。

4.根据权利要求2所述的一种筛选鲁棒性提高的水解酶的方法，其特征在于，步骤(2)

所述虚拟饱和突变是指利用软件将某一氨基酸突变为另外19种氨基酸。

5.根据权利要求2所述的一种筛选鲁棒性提高的水解酶的方法，其特征在于，步骤(3)

多尺度自由能计算是指从蛋白质动力学、蛋白质热力学、预测算法多角度计算，阳性突变体是指突变后的自由能小于突变前的自由能的突变体。

6.根据权利要求2所述的一种筛选鲁棒性提高的水解酶的方法，其特征在于，步骤(4)

将经过步骤(3)筛选出的阳性突变体交集中的突变体，利用定点突变技术，引入突变，利用基因工程菌表达突变体，测定经过分离纯化的酶的酶活，并进行圆二色谱分析，最终筛选出鲁棒性显著提高的突变体。

7.根据权利要求6所述的一种筛选鲁棒性提高的水解酶的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

将筛选得到的突变引入目标蛋白质：以带有水解酶基因的重组质粒为模板，以带有突变位点的寡聚核苷酸序列为引物，进行反向PCR，扩增突变质粒全长，采用Dpn I限制性内切酶进行酶切消化，将消化产物转入E.coil JM109，筛选成功转入消化质粒的E.coil JM109并扩大培养，从培养物中提取重组质粒，将重组质粒转入大肠杆菌或者酵母中进行诱导表达，得到单点突变的蛋白质；

使用填料为Ni-NTA的镍离子亲和层析柱或者离子交换层析，并借助AKTA纯化仪从大肠杆菌或者酵母的培养物中纯化得到发生单点突变的蛋白质，即为纯化酶；

将纯化酶透析，将透析后的酶液稀释至浓度为0.01-0.1mg·mL^-1，利用圆二色谱仪测定样品的解折叠温度(T_m)，温度梯度设置为20-100℃。

8.根据权利要求3所述的一种筛选鲁棒性提高的水解酶的方法，其特征在于，当某种水解酶没有晶体结构，可以从NCBI数据库下载该水解酶的一级序列，利用基本局部对齐搜索工具BLASTp进行同源序列标识，然后选择模板，利用同源建模软件进行同源建模并对模型进行调整和优化。

9.根据权利要求1-8任一项所述的一种筛选鲁棒性提高的水解酶的方法，其特征在于，水解酶至少包括：脂肪酶、氨基甲酸乙酯水解酶。