[发明专利]能够稳定表达TreT的重组ST细胞及其构建方法和应用

说明书

本发明属于生物技术领域，更为具体的说是涉及稳定表达海藻糖转运蛋白的重组ST细胞及其构建方法和应用。通过生物工程手段得到能够稳定表达海藻糖转运蛋白的重组ST细胞，进而通过在培养环境中加入海藻糖的方式，获得具有海藻糖积累能力的ST细胞。该细胞可以在增殖子代病毒的过程中对病毒起到保护作用，经实验，通过这种重组ST细胞增殖病毒，不仅在37℃的条件下显著提高病毒存活率，而且针对不同的冻存条件，都体现对病毒存活率的显著维持作用。

技术领域

本发明属于生物技术领域，更为具体的说是涉及稳定表达海藻糖转运蛋白的重组ST细胞及其构建方法和应用。

背景技术

海藻糖是一种非还原性二糖，由两分子吡喃环葡萄糖通过α,α-1,1糖苷键连接而成。具有稳定的化学性质。海藻糖可在高温、低温、高渗透压、干燥等极端环境下，为生物大分子提供有效的保护。

水生摇蚊(Polypedilum vanderplanki)幼虫能够在在干燥或盐胁迫等极端环境下大量积累海藻糖，从而在脱离极端环境后恢复活性。因此，水生摇蚊也被称为“脱水生物”。其原因，就在于水生摇蚊幼虫能够在极端环境下表达海藻糖转运蛋白(Trehalosetransporter，TreT)，从而将海藻糖转运至体内，实现海藻糖的积累。

ST细胞即猪睾丸细胞(swine testis)被广泛应用于囊膜病毒的增殖过程中。

通过生物技术手段得到具有合成或者转运海藻糖的能力的ST细胞从而提高子代病毒在低温冷冻环境下的存活率，这对于以病毒为基础原料的产品来说具有积极作用和重要意义。

因此，寻找一种能够具备合成或转运海藻糖能力的ST细胞是本领域技术人员的研究热点。但是，目前尚未有关于哺乳动物合成、转运海藻糖的相关报道，因此，这也成为本领域技术人员的研究难点。

发明内容

针对目前哺乳动物中尚未有关于海藻糖合成及转运的报道，本发明公开了一种能够稳定表达海藻糖转运蛋白的重组ST细胞以及该细胞的构建方法和在病毒增殖中的应用，从而有望实现动物细胞将培养环境中的海藻糖转运并积累至细胞内。

具体来说，本发明公开了一种能够稳定表达海藻糖转运蛋白的重组ST细胞 (ST-Sus-Tret-1)，该细胞于2020年11月6日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏编号为CGMCC NO.21010，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

该重组ST细胞中含有如SEQ ID:1所示的海藻糖转运蛋白编码序列Tret-1，所述的海藻糖转运蛋白编码序列Tret-1为是根据猪密码子偏嗜性进行优化的重组核苷酸序列。

同时，本发明还公开了所述重组ST细胞的构建方法，包括以下步骤：

(1)构建含有海藻糖转运蛋白编码序列的载体pCMV-Tret-1；

(2)将转染复合物滴加入ST细胞培养液中，转染，并利用G418筛选抗性中稳定持续生长的重组ST-Sus-Tret-1细胞。

其中，所述ST细胞为单细胞悬浮生长的ST-Sus细胞。

优选的，所述步骤(2)中利用G418进行两轮筛选，第一轮的筛选浓度为 500ug/ml，第二轮的筛选浓度为1000ug/ml。优选的，每一轮均采用20代连续筛选。

进一步的，在本发明中还公开了所述重组ST细胞(ST-Sus-Tret-1)在增殖病毒中的应用。

具体的，在本发明中进一步通过待增殖目标病毒对重组ST细胞(ST-Sus-Tret-1)进行单细胞克隆筛选，获得针对该目标病毒的单细胞克隆，从而用于该病毒的增殖。

在一个优选的技术方案中，所述重组ST细胞ST-Sus-Tret-1在增殖猪流行性腹泻病毒(PEDV)中的应用。