[发明专利]一种槟榔直接体胚诱导及其悬浮培养获得再生植株的方法

权利要求书

1.一种槟榔直接体胚诱导及其悬浮培养获得再生植株的方法，其特征在于，其步骤如下：

1)、外植体获取：选择高产健康槟榔单株，取佛焰苞未裂幼嫩花序作为外植体，冲洗干净，消毒，置于无菌滤纸上吸干表面水分；

2)、直接体细胞胚诱导：取经过消毒的外植体横切切成1～3mm厚的小片，接种到体胚诱导培养基中，在25～28℃下暗培养获得体细胞胚；所述体胚诱导培养基的成分和配比如下：NH₄Cl 1000～1300mg/L+H₃BO₃ 5～10mg/L+KNO₃2400～2600mg/L+Ca(NO₃)₂480～620mg/L+NaH₂PO₄300～350mg/L+MgSO₄·7H₂O 350～390mg/L+CuSO₄·5H₂O 0.25mg/L+Na₂-EDTA37.3mg/L+FeSO₄·7H₂O 27.8mg/L+MnSO₄·4H₂O 22～25mg/L+ZnSO₄·5H₂O 8.6mg/L+KI 5～10mg/L+Na₂MoO₄·2H₂O 0.1～0.3mg/L+CoCl₂·6H₂O 0.02～0.05mg/L+肌醇100mg/L+烟酸0.5～2mg/L+盐酸吡哆醇5～15mg/L+盐酸硫胺素1～5mg/L+氨基乙酸2.0mg/L+噻苯隆0.01～0.1mg/L+毒锈定2～50mg/L+蔗糖3000～45000mg/L+泛酸钙0.2～1.0mg/L+生物素0.05～0.5mg/L+谷氨酰胺500～1000mg/L+活性炭1000～2000mg/L，pH5.8；

3)、悬浮增殖培养

取体细胞胚接种到悬浮增殖培养液中，25～28℃、黑暗条件下摇床培养，每7d继代1次，每次继代时移除占总体积75％的上清液，补充新鲜的悬浮增殖培养液至原体积量继续培养；培养过程中，每14d过滤一次悬浮增殖培养液，保留直径为0.2～0.3mm的胚粒继续培养增殖，获得生长状态均一、分散性好的悬浮系；所述悬浮增殖培养液的成分和配比如下：NH₄Cl 1000～1300mg/L+H₃BO₃ 5～10mg/L+KNO₃2400～2600mg/L+Ca(NO₃)₂480～620mg/L+NaH₂PO₄300～350mg/L+MgSO₄·7H₂O 350～390mg/L+CuSO₄·5H₂O 0.25mg/L+Na₂-EDTA37.3mg/L+FeSO₄·7H₂O 27.8mg/L+MnSO₄·4H₂O 22～25mg/L+ZnSO₄·5H₂O 8.6mg/L+KI0.5～1.0mg/L+Na₂MoO₄·2H₂O 0.1～0.3mg/L+CoCl₂·6H₂O 0.02～0.05mg/L+肌醇100mg/L+烟酸0.5～2mg/L+盐酸吡哆醇5～15mg/L+盐酸硫胺素1～5mg/L+氨基乙酸2.0mg/L+噻苯隆0.1～0.5mg/L+毒锈定0.1～2mg/L+蔗糖3000～45000mg/L+泛酸钙0.2～1.0mg/L+生物素0.05～0.5mg/L+谷氨酰胺500～1000mg/L+活性炭1000～2000mg/L，pH5.8；

4)、体胚成熟培养

悬浮增殖培养过程中，每14d取直径大于0.3mm的胚粒转移到分化培养基中培养，在25～28℃、黑暗条件下，150rpm下悬浮培养，每7d更换培养基1次，55～65天获得1～2mm大小的体胚；所述分化培养基是以MS或WPM为基本培养基，并添加蔗糖3000mg/L、椰汁50～200ml/L、活性炭2000mg/L，pH5.8；

5)、植株再生

将获得的体胚接种到体胚萌芽培养基中，在26～30℃，1800～2200lx光照下培养得到再生植株；所述体胚萌芽培养基是以MS或WPM为基本培养基，并添加谷氨酰胺500～1000mg/L、蔗糖30000～45000mg/L、椰汁50～200ml/L、活性炭2000mg/L、6-BA1～3mg/L、琼脂7g/L，pH6.0。