[发明专利]一种利用鱿鱼软骨制备硫酸软骨素的方法

权利要求书

1.一种利用鱿鱼软骨制备硫酸软骨素的方法，其特征在于，其经过以下工艺步骤：

1）硫酸软骨素裂解酶制备

a.取新鲜鸭小肠，用破壁机粉碎，按重量份1:5-6添加无菌水制备鸭小肠溶液，搅拌10-20min，用160-180目筛子过滤，然后取滤液涂布培养基，进行平板培养分离，接着挑取单菌落，用斜面划线方法纯化；配制含有鱿鱼软骨粉末的培养基，将纯化后的单菌落点种于培养基平板，30℃-37℃恒温培养1-3天，向平板中倒入无菌水，浸泡3-5min；挑取产生透明圈的菌株，利用斜面划线培养,控制温度保持在30℃-37℃，120-150r/min振荡好氧培养1-3天；培养完成后，接种于液体培养基中进行生产菌的培养，在温度30-37℃、120-150r/min振荡通气培养1-3天，菌体密度为1×10⁸ - 5×10⁸个/ml时，即得硫酸软骨素裂解酶产生菌种子菌液；

b. 按4-6%v/v接种量将硫酸软骨素裂解酶产生菌种子菌液接入发酵罐中，在30℃-37℃发酵培养基，经48-60h发酵，用低温离心机5℃、4000-5500r/min离心20-30min,取上清液，在冰浴中缓缓向上清液中加入氯化钠、硫酸铵和乙醇复合物，5℃静置18-20h，低温离心机5℃、8000-10000r/min离心25-38min,取沉淀，用去离子水溶解，转移至透析袋中，透析脱除杂质即得硫酸软骨素裂解酶；

2）鱿鱼软骨酶解

a.取鱿鱼软骨，用清水冲洗除杂，晾干后用粉碎机粉碎，加入无水乙醇浸泡2-5h，离心取沉淀，用无水乙醇清洗几遍，晾干备用；

b.步骤a中备用的鱿鱼软骨按重量百分数20%-30%和水混合，按2%-5%混合物重量百分比添加步骤1）b中提取的硫酸软骨素裂解酶，温度45-51℃、pH8.5-10、100-120r/min酶解4-6h；

c.酶解完成后，离心除去沉淀，收集上清液并真空浓缩至固形物重量百分含量为30-35%；

3）纯化

a.步骤2）中获得的发酵浓缩液加入无水乙醇65-80%V/V，并调节pH5.2-7.0，搅拌30-60min，静置4-5h，离心去除上清液；

b.离心沉淀用去离子水溶解，溶液转入透析袋进行透析纯化，同时外加0.5-0.8V的直流电场，收集截留液，截留液中加入无水乙醇，使乙醇浓度达到74-81%V/V，同时调节pH5.5-6.5，静置8-10h，离心，重复结晶2-3次；

4）干燥

将步骤3）中得到的结晶冷风冻干，即得硫酸软骨素糖蛋白。

2.根据权利要求1所述的一种利用鱿鱼软骨制备硫酸软骨素的方法，其特征在于，在步骤1）中，所述的培养基为LB培养基、营养琼脂培养基或胰蛋白胨大豆肉汤培养基中的一种。

3.根据权利要求1所述的一种利用鱿鱼软骨制备硫酸软骨素的方法，其特征在于，在步骤1）中，所述的鸭小肠取自用虾蟹壳作饲料成分饲喂2-3年的鸭子。

4.根据权利要求1所述的一种利用鱿鱼软骨制备硫酸软骨素的方法，其特征在于，在步骤2）b中，在添加硫酸软骨素裂解酶前还加入了混合物重量2-4%CaCl2、3-5%乙醇。

5.根据权利要求4所述的一种利用鱿鱼软骨制备硫酸软骨素的方法，其特征在于，在步骤2）b中，在添加硫酸软骨素裂解酶前加入了混合物重量3.5%CaCl2、4%乙醇。

6.根据权利要求1所述的一种利用鱿鱼软骨制备硫酸软骨素的方法，其特征在于，在步骤3）b中，所述的透析袋规格为4-10kD，且为即用型。

7.根据权利要求1所述的一种利用鱿鱼软骨制备硫酸软骨素的方法，其特征在于，在步骤1）b中，所述的氯化钠、硫酸铵和乙醇复合物按重量百分数添加量为85-92%。

8.根据权利要求1或7所述的一种利用鱿鱼软骨制备硫酸软骨素的方法，其特征在于，所述步骤1）b中氯化钠、硫酸铵和乙醇复合物组成比例为W_氯化钠：W_硫酸铵：V_乙醇为1:6-8:3，其中W_氯化钠为氯化钠添加重量，W_硫酸铵为硫酸铵添加重量，V_乙醇为乙醇添加体积。