[发明专利]一种大规模生产重组Exendin-4多肽的发酵方法

说明书

本发明提供一种大规模生产重组Exendin‑4多肽的发酵方法，采用pET32a(+)‑Exendin‑4/BL21(DE3)发酵培养，在发酵中，以乳糖作为发酵培养的诱导剂。乳糖代替IPTG作为工程菌发酵培养的诱导剂，乳糖在发酵过程中会被菌体做为碳源分解代谢，不会产生毒性残留物质；此外，为使重组Exendin‑4多肽的工艺更加适用于产业化生产，对发酵工艺参数进行了优化，发酵规模由30L扩大为500L，优化后的菌体湿重、蛋白表达量(高达14.1％～14.6％)优于前工艺。

技术领域

本发明涉及产品发酵领域，具体涉及一种大规模生产重组Exendin-4多肽的发酵方法。

背景技术

IPTG作为基因工程菌调控乳糖操纵子的诱导剂，能够激活乳糖操纵子，使操纵子下游编码rExendin-4融合蛋白的基因表达，从而获得含有rExendin-4的融合蛋白。在工程菌的培养过程中IPTG不会被降解，IPTG具有潜在的毒性，影响最终原液的安全性。

发明内容

因此，本发明要解决的技术问题在于克服现有技术中的发酵生产重组Exendin-4多肽有毒性物质残留的缺陷，从而提供一种生产重组Exendin-4多肽的发酵方法，该方法不会产生毒性残留物质。

一种大规模生产重组Exendin-4多肽的发酵方法，采用pET32a(+)-Exendin-4/BL21(DE3)发酵培养，在发酵中，以乳糖作为发酵培养的诱导剂。

可选的，诱导的条件为，加入乳糖的终浓度为5g/L-20g/L；可选的为5g/L。

可选的，所述的诱导的条件为，诱导温度为25℃-40℃，诱导时间为4-6小时；

可选的，所述的诱导温度为25℃-30℃或30℃-40℃；

可选的，所述的诱导时间为4-6小时，可选的为6小时。

可选的，发酵过程还包括加入补料培养基的步骤；

可选的，在开始诱导时加入补料培养基；

可选的，发酵使用的发酵培养基为TB培养基；

可选的，所述TB培养基含有8mL/L甘油。

可选的，菌体OD₆₀₀值为8～12时，加入诱导剂。

可选的，发酵培养基的体积为50L-500L；可选的，为200L。

可选的，诱导剂分1-6次加入；可选的为2-6次加入；可选的，将开始诱导时记为第0小时，于第0、1、2、3、4小时各加1/5体积诱导剂。

可选的，发酵之前还包括：1)一级种子制备和2)二级种子制备的步骤。

可选的，一级种子制备方法：取申请号为200410052039.4制备的pET32a(+)-Exendin-4/BL21(DE3)原始菌液，按1‰(v/v)接种量接种到1500mL一级种子培养基中，培养温度为36℃-38℃(可选的为37℃)，转速为220rpm-270rpm(可选的为250rpm)，振荡培养15～17h，得到一级种子培养物；

可选的，二级种子制备方法为：将一级种子培养物移种到培养基体积为30L-50L发酵罐中，温度设置37℃，转速250rpm，振荡培养2.0～3.0h，测OD₆₀₀值达到3.0～5.0后，得到二级种子培养物；

可选的，补料培养基由MgSO₄·7H₂O、胰蛋白胨、酵母提取物和甘油组成，MgSO₄·7H₂O的浓度为11-12g/L g/L，胰蛋白胨的浓度为98g/L-102g/L、酵母提取物的浓度为98g/L-102g/L，甘油的体积百分数为20％。