[发明专利]用于构建MC4R基因突变的肥胖症猪核移植供体细胞的CRISPR系统及其应用

说明书

本发明公开了用于构建MC4R基因突变的肥胖症猪核移植供体细胞的CRISPR系统及其应用。该系统包含Cas9表达载体和针对猪MC4R基因的gRNA表达载体；所述的Cas9表达载体为质粒全序列如SEQ ID NO.2所示，所述的gRNA表达载体表达SEQ ID NO.22所示的gRNA；且该表达载体的载体骨架为pKG‑U6gRNA，质粒全序列如SEQ ID NO.3所示。采用本发明筛选的gRNA联合改造的Cas9高效表达载体进行基因编辑,编辑效率比原载体有了显著的提高。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及用于MC4R基因编辑的CRISPR/Cas9系统及其应用。

背景技术

肥胖症(Obesity)是指体脂肪累积过多而对健康造成负面影响的身体状态，可能导致寿命减短及各种健康问题。尽管肥胖通常受到遗传和环境的共同影响，但肥胖症实际上是可遗传且由多基因作用的，只是不同人的易感性存在差异。在极少数情况下，遗传性肥胖症是由致病突变直接干扰能量稳态或脂肪沉积，例如人类单基因肥胖病的发生。其中，黑皮质素4受体(MC4R)基因的突变是造成人类先天性肥胖症最重要的基因之一。MC4R表达的增加可抑制食物的摄入，突变造成MC4R功能的丧失可引起肥胖、食欲亢进和严重的高胰岛素血症。因此，迫切需要开发出基于MC4R突变导致的先天性肥胖症动物模型以尽快解开发病机制谜团并为进一步的治疗奠定基础。猪作为大动物，是人类长期以来主要的肉食供应动物，易于大规模繁殖饲养，而且在伦理道德及动物保护等方面的要求较低，且猪体型大小和生理功能与人类近似，是理想的人类疾病模型动物。

基因编辑是近年来不断取得重大发展的一种生物技术，其包括从基于同源重组的基因编辑到基于核酸酶的ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9等，其中CRISPR/Cas9技术是当前最先进的基因编辑技术。目前，基因编辑技术被越来越多地应用到动物模型的制作上。猪作为大动物，是人类长期以来主要的肉食供应动物，其体型大小和生理功能与人类近似，易于大规模繁殖饲养，而且在伦理道德及动物保护等方面要求较低，是理想的人类疾病模型动物。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种用于MC4R基因编辑的CRISPR/Cas9系统。

本发明的另一目的是提供用于MC4R基因编辑的gRNA及其表达载体。

本发明的又一目的是提供所述的CRISPR/Cas9系统在构建MC4R基因突变的猪重组细胞中的应用。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

一种用于猪MC4R基因编辑的CRISPR/Cas9系统，包含Cas9表达载体和针对猪MC4R基因的gRNA表达载体；所述的Cas9表达载体为质粒全序列如SEQ ID NO.2所示的pU6gRNA-eEF1a-mNLS-hSpCas9-EGFP-PURO载体。

为了增加Cas9质粒的基因编辑能力，我们在购自addgene(Plasmid#42230，fromZhang Feng lab)pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9(简称PX330)载体的基础上进行改造得到pU6gRNA-eEF1a-mNLS-hSpCas9-EGFP-PURO(简称粒pKG-GE3)。PX330的图谱如图1，改造方式如下：

1)去除原载体gRNA骨架中多余无效的序列；

2)改造启动子：将原有启动子(chickenβ-actin启动子)改造为具更高表达活性的EF1a启动子，增加Cas9基因的蛋白表达能力；

3)增加核定位信号：在Cas9的N端及C端均增加核定位信号编码序列(NLS)，增加Cas9的核定位能力；

4)增加双筛选标记：原载体无任何筛选标记，不利于阳性转化细胞的筛选和富集，在Cas9的C端，插入P2A-EGFP-T2A-PURO，赋予载体荧光和抗性筛选能力；