[发明专利]基于CRISPR/Cas9基因编辑方法的一种培育自交亲和甘蓝的方法及其应用

说明书

本发明提供基于CRISPR/Cas9基因编辑方法的一种培育自交亲和的甘蓝的方法及其应用。本发明培育自交亲和甘蓝的方法利用CRISPR/Cas9基因编辑方法快速、高特异性的敲除了自交不亲和相关的SRK基因。本发明的一个具体实施例通过设计sgRNA序列，快速构建了含有SRK15基因靶位点序列的CRISPR/Cas9基因敲除载体，通过农杆菌介导的遗传转化，定点编辑控制甘蓝自交不亲和的基因，筛选获得的SRK15基因敲除的突变植株6株，因此，通过本发明，可以获得不含有任何转基因成分的自交亲和的甘蓝新种质，可以直接应用到育种过程中，在配制杂种一代时可降低自交不亲和反应发生，增加杂种一代的产量。

技术领域

本发明涉及基于CRISPR/Cas9基因编辑方法的一种培育自交亲和甘蓝的方法及其应用。

背景技术

植物自交不亲和机制已经得到了广泛系统的研究，自交不亲和分为配子体自交不亲和型(Gametophytic SI，GSI)与孢子体自交不亲和型(Sporophytic SI，SSI)。在十字花科植物中，SSI受单一位点的复等位基因控制，此位点命名为S-位点。此位点通常包含三个紧密连锁、高度多态性的基因：S-位点受体激酶(S-locus receptor kinase，SRK)、S-位点半胱氨酸富集蛋白/S-位点蛋白11(S-locus cysteine rich protein/S-locus protein11，SCR/SP11)和S-位点糖蛋白(S-locus glycoproteins，SLG)。S-位点上所有的等位基因被称为“S单元型”。SRK基因编码一个跨膜的丝氨酸/苏氨酸受体激酶，在柱头乳突细胞中特异性表达，是柱头SI决定因子(Takasaki et al.2000)。SCR/SP11基因编码一个定位在花粉粒表面的半胱氨酸富集蛋白，是花粉SI的决定因子(Schopfer et al.1999；Shiba etal.2001；Takayama et al.2000)。SLG基因编码的是一个能够被分泌到柱头乳突细胞的糖蛋白，在SI识别反应中没有主要作用，只是起到了增强SRK活性和稳定性的功能(Nasrallahet al.1985；Takasaki et al.2000)。遗传和生化研究将SRK和SCR确定为SI特异性的唯一决定因素，SRK和SCR互作激活自交不亲和信号级联响应，使柱头区分SI反应中的“自我”和“非自我”花粉，从而抑制花粉的萌发与花粉管穿透乳突细胞细胞壁并伸长等过程(Kachrooet al.2001；Ma et al.2016)，导致自交不亲和的发生。

现如今，芸苔属作物自交不亲和研究主要集中在分子生物学及遗传机理方面，并已取得了显著的成果，已鉴定出大量复等位基因，在甘蓝类作物中已鉴定出来80多个S单元型(Brace et al.1994；Nouiii et al.1993)，这为提高芸苔属自交不亲和系选育效率奠定了良好的基础。根据自交不亲和表型以及序列的相似性，将芸苔属作物自交不亲和性S单元型分为class I和classII两类(Chen and Nasrallah 1990)。利用芸苔属植物自交不亲和性遗传机理发展而来PCR-RFLP、DNA测序等方法可以精确鉴定植株的S单元型和自交不亲和性，在育种前预先了解植株相应S单倍型的遗传效应，从而根据S单元型设计杂交组合，大大提高了芸苔属作物的育种效率(康俊根，2005)。

甘蓝是典型的孢子体型自交不亲和作物，传统遗传育种杂种优势利用均采用自交不亲系配制F1杂种。近年来，由于可以保证100％的纯度，甘蓝雄性不育的应用已经逐渐取代自交不亲和(Self-incompatibility，SI)而成为国内外甘蓝新品种创制的主要育种手段。但由于甘蓝育种材料中自交不亲和性基因的普遍存在，造成目前纯大部分骨干自交系均为自交不亲和系，甘蓝育种过程中，将两个品系优良的品系进行杂交制种时，会因自交不亲和而造成结实率低产量少，此外在遗传育种中雄性不育系和父本的繁殖均需要蕾期授粉，耗费大量人力物力且产量较低，成为当前甘蓝杂种优势利用的一大瓶颈。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何降低甘蓝自交不亲和反应发生，提高甘蓝育种效率。