[发明专利]一种用于制备水凝胶的胶原蛋白及其制备方法

说明书

本发明涉及一种用于制备水凝胶的胶原蛋白及其制备方法，设计了含有生物活性结构GFPGER区域的胶原蛋白序列，并在胶原蛋白序列的若干位点引入具有氧化交联特性的半胱氨酸，通过大肠杆菌异源表达获得四种纯度较高的含半胱氨酸胶原蛋白。采用双氧水为交联剂对胶原蛋白进行交联制备得到水凝胶。本发明制备得到的胶原蛋白具有较好的温敏性，在氧化环境中能够形成稳定的水凝胶构筑，并对细胞无毒性，为药物控释载体的应用提供了较好的基础。

技术领域

本发明涉及一种用于制备水凝胶的胶原蛋白及其制备方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

胶原蛋白是一类重要的生物高分子材料，为动物结缔组织的主要成分，是哺乳动物体内含量最多、分布最广的功能性蛋白，占蛋白质总量的30％左右。胶原蛋白具有良好的生物相容性、低免疫原性和组织可降解吸收性，在创面止血、愈合，缺损组织的填充、修复及重建，对生物体进行诊断、治疗、修复以及药物载体和组织工程等方面有广泛应用，是理想的医用生物材料。

天然胶原蛋白来源广泛，主要存在与动物的肌腱、骨、皮肤、韧带等组织中，是胶原蛋白原料的主要来源。提取胶原蛋白的方法有酸法、碱法、盐法、酶法。然而，在提取中存在蛋白变性、结构破坏、蛋白得率低等问题，并可能产生致病和免疫不良反应及批次间的差异性问题。人工重组合成胶原蛋白成为一种新的途径。重组类人胶原蛋白是采用生物基因工程技术将胶原蛋白的基因片段，借助工具酶拼接到适合的载体然后转移到宿主细胞中诱导表达得到，具有质量可控、加工性强、水溶性好、周期性短、较低排斥反应等优点，常见的宿主表达系统有大肠杆菌、酵母菌等。然而，与人工化学合成的高分子蛋白相比，胶原蛋白在力学特性方面仍然存在缺陷，其无法进行自组装或被加工成纳米颗粒、水凝胶等多种材料形式，在药物控释、药物传输及组织工程等领域的应用前景还有待进一步挖掘。存在成胶所需蛋白浓度高、成胶时间等缺点，限制了其在药物传输及组织工程的应用。

水凝胶材料由于其质地柔软，可模拟天然细胞外基质，具备应用于体内生理环境的天然特性等，正受到广泛关注。目前已报道的有人工合成类丝弹性蛋白水凝胶，其主要基于丝蛋白肽段单元间的物理交联形成凝胶网络，可快速温和氧化成胶，并赋予该水凝胶以氧化还原响应性及可调的力学性能，使其潜在应用于可控的药物传输及组织工程，但此类水凝胶与细胞之间的粘附作用差，不适合进行体内应用。

发明内容

本发明是为了解决上述提出的问题，提供了一种用于制备水凝胶的胶原蛋白及其制备方法。

本发明采用如下技术方案：

一种用于制备水凝胶的胶原蛋白S-VCL-S，其序列为SEQ ID No.1所示。

一种用于制备水凝胶的胶原蛋白S-VCL-S1，其序列为SEQ ID No.2所示。

一种用于制备水凝胶的胶原蛋白S-VCL-S2，其序列为SEQ ID No.3所示。

一种用于制备水凝胶的胶原蛋白S-VCL-S3，其序列为SEQ ID No.4所示。

所述胶原蛋白的制备方法，将带有胶原蛋白基因的pET-28a质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，挑取单克隆进行摇瓶发酵生产，收集菌体，得到重组蛋白；将重组蛋白分离纯化后最终得到目标胶原蛋白。

进一步地，具体步骤如下：

(1)设计胶原蛋白序列，将该基因片段连接至pET-28a质粒上，并设计双酶切位点，以验证携带的基因片段；

(2)采用已经验证片段的pET-28a质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)；挑取单克隆进行蛋白表达测试，验证其转化结果；

(3)挑取单克隆依次进行摇瓶发酵生产、分离纯化，最后得到目标胶原蛋白。

进一步地，所述步骤(1)中在基因两端设计了限制性内切酶Nco I和Bam HI位点，通过酶切验证其基因长度。