[发明专利]基于杂交链式反应放大输出信号的检测方法及其检测试剂盒

说明书

本发明提供一种基于杂交链式反应放大输出信号的检测方法及其检测试剂盒。检测方法包括目标序列选择：选取待扩增单链核酸分子的至少一个特异性目标序列和至少一个非特异性目标序列作为目标序列；发夹探针设计：针对选取的一个或多个特异性目标序列设计与之分别发生杂交链式反应的对应组数探针对，针对选取的一个或多个非特异性目标序列设计与之分别发生杂交链式反应的对应组数探针对，使得所述一个或多个特异性目标序列和一个或多个非特异性目标序列可以在前述对应探针对作用下都发生杂交链式反应从而被扩增和放大输出信号；以及基于杂交链式反应的胶体金试纸条检测。本发明还提供前述方法对应的检测试剂盒，其具有检测方便、灵敏的技术效果。

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种基于杂交链式反应放大输出信号的检 测方法及其单链核酸分子检测试剂盒。

背景技术

杂交链式反应原理

杂交链式反应(Hybridization Chain Reaction，HCR)的相关原理最早由Dirks和Pierce 于2004年首次提出(参见：Triggered amplification by hybridization chainreaction R.M. Dirks and N.A.Pierce,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,2004,101,15275–15278)。杂交链式反 应是一种基于无酶辅助的体外等温信号扩增放大技术，属于自组装信号扩增技术。相较 热循环扩增技术，包括多聚酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)和连接酶链式 反应(Ligase Chain Reaction，LCR)而言，杂交链式反应具有条件简单(恒温)、操作简便(无 需昂贵的专业仪器)、成本低(无需酶介导)、扩增反应动力学可控、灵敏度较高等优点(参 见梁栋国,陈星兆,吴宏祥,等.杂交链反应在生物传感检测技术中的应用[J].安徽医科 大学学报,2018,053(012):1976-1980)。基于前述优点，杂交链式反应在生物传感领域的 DNA、miRNA、蛋白质以及金属离子的检测中得到了广泛关注(参见刘永新,袁旦,陈沁, 等.杂交链式反应技术结合纳米材料用于核酸检测的研究进展[J].中国材料进展,2020, 039(004):325-331)。

如图1所示，Dirks等人提出的杂交链式反应原理主要是利用发卡型探针H1、H2为部分互补的两条单链DNA片段，在加入引物I后，由于其与第一发夹探针H1的ab段互 补，形成的双链aa*bb*比发卡结构更加稳定，从而引发其进行互补反应。同时，由于发 卡打开而变成单链的cb*段与第二发夹探针H2的c*b段互补，同理会引发第二发夹探针 H2开环，由此反应不断持续下去，发生链式反应，形成长链。虽然杂交链式反应无需酶 参与，不需要升降温过程，可以基于链置换的循环扩增方法，依赖单链核酸探针分子内 部竞争杂交获取能量来源，形成组装结构。

但是，由于杂交链式反应产物长链与PCR产物不同，杂交链式反应下探针与探针之间没有形成化学键，而是依靠核苷酸之间的氢键作用相互连接，这就导致了链延长到一 定程度以后，空间位阻会越来越大大，分子受外力也就越来越大，使得单链核酸链变得 不稳定而无法进行足够的扩增。而如果链不够长，相对于单链核酸分子巨大的分子量， 杂交链式反应产生的放大效应比较小，使这个方法相较PCR没有扩增效果上的优势。

基于杂交链式反应的试纸条检测