[发明专利]一种基于点亮型RNA适体的CRISPR-Cas13核酸检测试剂盒

说明书

本发明公开了一种基于点亮型RNA适体的CRISPR‑Cas13核酸检测试剂盒，所述试剂盒包括：点亮型RNA适体、Cas13蛋白、crRNA和核酸染料；所述点亮型RNA适体可结合核酸染料并使其发射荧光，点亮型RNA适体如果被Cas13蛋白剪切，则荧光淬灭；所述crRNA为一段RNA，可与Cas13蛋白形成crRNA‑Cas13复合物，当Cas 13‑crRNA结合靶标RNA序列以后，激活Cas13蛋白的酶切活性，切除RNA适体。本发明的试剂盒可通过检测RNA来检测活病原体和RNA标志物，相较于现有的基于CRISPR‑Cas13的核酸检测方法，该方法不依赖逆转录和核酸扩增，一步完成靶标RNA序列检测，检测成本低，操作步骤简单，且能保证较高的特异性和灵敏度，利于产业化应用。

技术领域

本发明属于核酸检测领域。

背景技术

由病原菌或者病毒引起地传染疾病是威胁人类健康的最重要因素。此外，外周血核酸逐渐被公认为包括癌症在内的分子标志物，可以应用于疾病的早期预警。近年来，对病原菌、病毒、疾病标志物等生物体的分子检测得到了广泛的应用，主要包括抗体检测和核酸检测。

由于抗体在血清免疫中的重要性，抗体检测在分子检测领域非常重要，例如，广东康健生物科技医药公司的专利申请CN 111562370 A公开了一种基于胶体金的病毒抗体检测方法，可获得快速准确的病毒检测结果。然而，与基于蛋白质的抗体相比，核酸具有化学稳定性好、再生方便、储存方便等优点。并且，核酸检测可以直接地，在病原菌感染、病毒感染或者肿瘤细胞出现地早期检测基因来确定是否感染或者患病。因此，核酸检测技术分析已经被广泛应用于实际样品检测。其中荧光定量PCR(qPCR)技术是最强有力的定量工具。例如，2020年5月26日授权的专利CN 110982876 B采用qPCR扩增技术，实现了病毒的高效短时间检测。此外，基于荧光，电化学和比色原理的DNA生物传感器也得到了开发和应用。通过分子探针(例如DNA，mRNA和rRNA)监测生物体生存能力，对于生物体的核酸检测至关重要。

但是，由于DNA可长期存在于生物体的任意生存状态，并不能作为生物体活性鉴定的的理想指标。相比较而言，RNA会随着生物体的死亡在短时间内降解，是生物体活性的标志。目前也有大量学者构建了一些节省时间和成本效益，可以通过RNA检测来定量生物体的方法。但这些方法无法满足同时具有高效率、高灵敏度、强特异性和低成本的需求。

CRISPR-Cas(聚簇的规则间隔的短回文重复序列)是一类特殊的核酸蛋白复合体，一般具有RNA降解酶(RNase)或DNA降解酶(DNase)的活性。其中，在Cas蛋白中，Cas 13可以结合并切割RNA，是一种RNA导向酶。该切割过程需要CRISPR RNA(crRNA)的参与。crRNA是一种由锚定序列和向导序列组成的RNA，其向导序列负责与特征单链RNA通过碱基互补配对相结合，形成杂交RNA，而锚定序列则可辅助前述杂交RNA进入Cas13的特定结构域，激活Cas13的酶切活性，进而特征单链RNA被切割，切割后，Cas13会保持活性，对所处环境中的其他RNA分子进行非特异性的切割，被称作“旁切割(collateral cleavage)”。

Cas13a是Cas13家族中的一员。国家纳米科学中心的专利申请CN 107557455A公开了一种核酸检测方法，其利用CRISPR-Cas13的思路是：通过crRNA结合靶点RNA，激活CRISPR-Cas13复合体中Cas13a的酶切活性，会剪切检测体系中添加的信号分子。该信号分子是预先加入的两端分别带有荧光基团和淬灭基团的RNA，RNA被剪切后，荧光基团就会发出荧光。该方法的灵敏度很高，可达到10^-18M。但是该灵敏度完全依赖对其模板提前进行恒温扩增(RPA)，提高模板量。目前RPA检测的最低检测限可达1拷贝(CN111593141A)。但是，CN107557455A的方法存在如下局限性：其信号分子制备需要在RNA的两头标记荧光基团和淬灭基团，同时在实际样品检测时需要提取RNA先逆转录成DNA再扩增检测，导致检测成本极其昂贵，操作流程也十分复杂。