[发明专利]一种非酒精性脂肪性肝炎的miRNA标志物的制备方法

权利要求书

1.一种非酒精性脂肪性肝炎的miRNA标志物的制备方法，其特征在于：它的操作步骤如下：

步骤(一)、从NCBI的GEO数据库中筛选出2个符合条件的人非酒精性脂肪性肝炎，即，NASH相关模型miRNA测序数据集和7个符合条件的小鼠NASH相关模型的miRNA测序数据集，下载这些数据集然后分别进行miRNA差异表达分析并取交集；

步骤(二)、分别对步骤(一)中得到的9个miRNA测序数据集进行差异miRNA的表达分析，得到9组差异表达miRNA；取9组差异表达miRNA的交集，得到在人和小鼠NASH中都差异表达的miRNA；

步骤(三)、根据文献资料，构建蛋氨酸胆碱缺乏饮食诱导的小鼠NASH模型，并记录小鼠体重；小鼠NASH模型构建成功后，进行小鼠眼球取血并通过颈椎脱臼法处死小鼠，进行解剖取组织样，一部分用甲醛固定，一部分放-80摄氏度冰箱保存待用；解剖时进行小鼠肝脏拍照；

步骤(四)、将步骤(三)中得到的血清进行甘油三脂和总胆固醇的检测，得到小鼠NASH模型中的血清学指标，再次确认小鼠模型构建成功；

步骤(五)、将步骤(三)中得到的一部分用甲醛固定小鼠肝组织进行苏木精伊红染色和油红染色，检测NASH模型鼠肝脏中脂质积累情况；

步骤(六)、将步骤(三)中得到的一部分放-80摄氏度冰箱保存待用的小鼠肝组织分别提取总RNA；

步骤(七)、将步骤(六)中得到的小鼠肝组织总RNA进行反转录；

步骤(八)、以步骤(七)中得到的反转录产物为模板，检测步骤(二)中得到的人和小鼠NASH中都差异表达的miRNA；

步骤(九)、将步骤(八)中得到的miRNA表达结果与步骤(二)中的表达结果进行比对，选取表达趋势一致，且表达差异最明显的2种miRNA作为判断非酒精性脂肪性肝炎的标志物。

2.根据权利要求1所述的一种非酒精性脂肪性肝炎的miRNA标志物的制备方法，其特征在于：所述的步骤(一)中所述的NASH miRNA测序数据集，是从GEO数据库中搜索的数据集，经过条件筛选得到，筛选条件为：HFD、NAFLD、NASH、miRNA、tissue；每个数据集最少包含5个样本的正常组和5个样本的处理组；每个数据集有一个数据矩阵，行名为miRNA名称，列名为样本名称。

3.根据权利要求1所述的一种非酒精性脂肪性肝炎的miRNA标志物的制备方法，其特征在于：所述的步骤(二)中分别对得到的9个miRNA测序数据集进行差异miRNA的表达分析，利用R语言中limma包进行差异miRNA的表达数据分析，上述差异miRNA表达分析的阈值条件均设置为：|log₂FC|1，且FDR0.05；FC为差异倍数，FDR为伪发现率；满足阈值条件的基因为差异表达基因；分别得到9组差异表达的miRNA。

4.根据权利要求1所述的一种非酒精性脂肪性肝炎的miRNA标志物的制备方法，其特征在于：所述的步骤(二)中得到的人和小鼠NASH中都差异表达的miRNA包括miR-210、miR-222、miR-301a-3p、miR-532-5p。

5.根据权利要求1所述的一种非酒精性脂肪性肝炎的miRNA标志物的制备方法，其特征在于：所述的步骤(三)中的小鼠NASH模型是利用MCD饮食诱导构建的，周期为2-3周，所用小鼠为6-8周的C57BL/6J小鼠；血样是通过小鼠眼球取血获得，分为两份，一份用于检测血样中的甘油三脂TG、总胆固醇含量TC、天门冬氨酸氨基转移酶和丙氨酸氨基转移酶含量；另一份用于检测血样中的miRNA。

6.根据权利要求1所述的一种非酒精性脂肪性肝炎的miRNA标志物的制备方法，其特征在于：所述的步骤(九)中所检测miRNA在NASH小鼠模型肝脏中的表达趋势与步骤(二)中得到的在人和小鼠NASH中差异表达的miRNA表达趋势一致，分别是miR-301a-3p和miR-532-5p这两种miRNA。