[发明专利]无血清培养基制备脂肪间充质干细胞的方法

权利要求书

1.分离培养原代脂肪间充质干细胞的方法，包括如下步骤：

(1)在生物安全柜中处理经2-8℃冷链运输至实验室的脂肪样本；

(2)使脂肪样本离心，移取上层脂肪组织，再使用D-Hanks液清洗一遍，再次离心，移取脂肪组织，加入1% Ⅱ型胶原酶振荡消化；

(3)消化结束后，加一倍体积D-hanks液稀释，离心，留取底层的细胞沉淀进行接下来的操作；

(4)取步骤(3)所得细胞沉淀，加入原代增补培养基重悬，取样计数，按照规定细胞量接种至培养瓶；置CO₂培养箱中培养；

(5)培养3d后培养基全换液一次，至细胞融合度达80%以上后，去旧培养基，用D-hanks液清洗细胞，加入重组胰酶溶液消化细胞，使细胞脱落，加入D-hanks液稀释，离心，将细胞沉淀用原代增补培养基重悬，即得原代脂肪间充质干细胞；

其中，所述原代增补培养基是以DMEM-F12培养基为基质配制并加入：1%血小板裂解物、1%人血白蛋白、2μg/ml重组胰岛素、15ng/ml的EGF、25ng/ml的bFGF、0.12%硫代甘油、1%果糖。

2.根据权利要求1的方法，其中步骤(2)中，两次离心均以100xg离心5min的条件进行操作。

3.根据权利要求1的方法，其中步骤(2)中，加入2倍体积的1% Ⅱ型胶原酶振荡消化30min。

4.根据权利要求1的方法，其中步骤(3)中，离心以100xg离心5min的条件进行操作。

5.根据权利要求1的方法，其中步骤(4)中，按照规定细胞量接种至培养瓶是指按照细胞量1~5×10⁴/cm²接种至T75瓶。

6.根据权利要求1的方法，步骤(4)中，CO₂培养箱中培养的条件为：5% CO₂，37℃，饱和湿度。

7.根据权利要求1的方法，其中步骤(5)中每瓶加2ml重组胰酶溶液消化细胞2min。

8.根据权利要求1的方法，步骤(5)中以100xg离心10min。

9.根据权利要求1的方法，步骤(5)中每瓶加入10ml的D-hanks液稀释。

10.根据权利要求1的方法，其中所述D-Hanks液的配方组成如下：8.0g的NaCl、0.4g的KCl、0.06g的KH2PO4、0.08g的Na2HPO4.12H2O、0.35g的NaHCO3、水至1000ml。

11.根据权利要求10的方法，其中所述D-Hanks液配制方法如下：将各物料用1000ml溶解，0.22µm微孔滤膜过滤除菌，即得。