[发明专利]利用液态热响应型聚合物EO20

说明书

本发明涉及利用热响应型聚合物环氧乙烷‑环氧丙烷无规共聚物水溶液经温度诱导形成两水相分离纯化单克隆抗体。本发明通过将EO₂₀PO₈₀与单克隆抗体细胞培养液按照体积比1:3混合均匀，调节pH至9.0，并通过温度诱导形成两水相体系，使细胞培养液中的单克隆抗体转移并富集于下相EOPO中；通过将上相去除，并向其中加入与下相等体积的缓冲液，调节pH至4.5，通过温度诱导使单克隆抗体由下相EOPO转移并富集于上相缓冲液中，利用正向萃取与反向萃取实现单克隆抗体的分离纯化，通过温度调节热响应型聚合物的回收率达97.66％。

技术领域

本发明涉及两水相萃取技术领域，更具体地，涉及可再生型两水相萃取技术领域，特别是指利用单一温敏聚合物构建可回收型两水相体系在单克隆抗体分离纯化过程中的工艺设计与优化。

背景技术

可再生两水相体系是利用热响应型聚合物构建两水相体系，通过将热响应型聚合物的高效回收，实现两水相体系的重复再利用。

环氧乙烷(EO)-环氧丙烷(PO)无规共聚物(EOPO)是一种热响应型聚合物，可根据环氧乙烷与环氧丙烷的比例，调节其亲疏水性合成不同浊点的热响应型聚合物，其中常用包括EO₂₀PO₈₀、EO₃₀PO₇₀、EO₅₀PO₅₀，并可根据分离目标物质的性质选择合适浊点的EOPO。EOPO水溶液通过温度诱导可形成两水相体系，当温度升高至其浊点上15℃，可形成上、下界面清晰的两相，而当温度低于其浊点时，该水溶液为均一溶液，无法形成两相。两水相体系可通过对温敏型聚合物的回收实现该体系的回收再利用。

可再生两水相体系其含水量高，聚合物可被高效回收，与传统的有机溶剂萃取相比，该萃取条件温和，有效避免产品活性的损失。可再生型两水相体系具有绿色环保、操作安全且不需要进行防火防爆的特点。利用该两水相体系具有分配系数高，易实现绿色环保分离纯化单克隆抗体。

可再生型两水相萃取技术在生物大分子类药物生产方面具有独特优势与较好的应用前景，但形成可再生型两水相体系的响应型聚合物合成方法较为复杂，价格昂贵且不利于工业放大，两种响应型聚合物成相面临相分离时间过长，且工艺不够成熟，目前只停留在小试阶段，这极大限制了可再生型两水相体系的发展。

因此，利用单一热响应型聚合物构建可再生两水相体系可快速成相，目标物质在该体系中的分配系数高且该热响应型聚合物可被高效回收，利用绿色环保的方法分离纯化单克隆抗体成为本领域亟待解决的问题。

发明内容

本发明主要针对上面的问题，提供了一种热响应型可再生两水相体系分离纯化单克隆抗体的工艺方法，该两水相体系成相聚合物为热响应型EO₂₀PO₈₀，其浊点为27℃，分子量为3KDa，诱导温度高于其浊点10℃以上可形成两水相，该聚合物为热响应型液态聚合物，相较于固态聚合物，该液态聚合物通过改变溶液温度可被高效回收，易于分相，成相时间短，并可显著降低单克隆抗体的分离纯化成本，易于实现绿色环保分离单克隆抗体的目标，且该技术易于工业放大。

为了实现上述的目的，本发明提供了一种分离纯化单克隆抗体的方法，其主要特点是，所述的方法包括：

正向萃取步骤：将EO₂₀PO₈₀与单克隆抗体细胞培养液按照1:3的体积比混合均匀，并调节pH至9.0，静置于40℃水浴锅30分钟后，即可分成上下界面清晰的两相，取出离心，并将上相萃余液去除；

反向萃取步骤：加入与正向萃取步骤中的下相等体积的25mM柠檬酸-柠檬酸钠缓冲体系，并加入正向萃取步骤中加入的EO₂₀PO₈₀等体积的水，混合均匀并调节pH至4.5，静置于40℃水浴锅，直至形成上下界面清晰的两相，经过反向萃取，单克隆抗体富集于上相水溶液中。