[发明专利]一种基于高通量测序技术检测马凡及其类综合征相关突变基因的方法

权利要求书

1.一种基于高通量测序技术检测马凡及其类综合征相关突变基因的方法，其步骤包括，

(1)样本收集：

选取马凡及其类综合征相关的8个致病基因FBN1、TGFBR1、TGFBR2、SMAD3、TGFB2、TGFB3、SKI、FBN2；

(2)panel设计：

试剂盒由7管试剂构成，

其中5管试剂保存在-20℃，包括1管IGT-I7 Index(10uM)试剂、1管IGT-I5 Index(10uM)试剂、1管Primer pool试剂、1管IGT-EM808 polymerase mixture试剂和1管Enhancer buffer NB(1N)试剂；

另2管试剂保存在4℃，包括1管Enhancer buffer M试剂和1管YF buffer B试剂；

设计的试剂盒中，Primer pool试剂共包含213个扩增子，扩增子的序列为1-213，每个扩增子均包括一个正向引物和一个反向引物，正向引物和反向引物的序列为SEQ ID No.1-SEQ ID No.426；

(3)文库构建：

(3.1)第1轮多重PCR反应

在PCR管、排管或PCR板中按下表配方配制反应液，用枪轻柔地上下吹吸混匀；

运行PCR仪，放入上述PCR管，按下列程序进行反应：先95℃210s，之后执行循环程序：98℃10s、60℃5min循环18次，最后72℃延伸5min；

(3.2)磁珠纯化合并产物

(3.2.1)向30ul步骤(3.1)处理的PCR产物中加入27ul室温平衡后的AMPure XP磁珠，用移液器吸打混匀20次；

(3.2.2)室温孵育5min后，将PCR管置于DynaMag-96Side磁力架上3min；

(3.2.3)彻底移除上清，将PCR管从磁力架取下，向管内加入50ul YF buffer B并用移液器吸打混匀20次；

(3.2.4)室温孵育5min后，将PCR管置于DynaMag-96Side磁力架上3min；

(3.2.5)移除上清，PCR管继续放置在磁力架上，向管内加入180ul体积百分比浓度80％乙醇溶液，静置30s；

(3.2.6)移除上清，PCR管继续放置在磁力架上，向管内加入180ul体积百分比浓度80％乙醇溶液，静置30s后彻底移除上清；

(3.2.7)室温静置3min，使残留乙醇彻底挥发；

(3.2.8)将PCR管从磁力架取下，加入24μl的Nuclease-free water，移液器轻轻吸打重悬磁珠，避免产生气泡，之后室温静置2min；

(3.2.9)将PCR管重新置于磁力架上，静置3min；

(3.2.10)用移液器吸取13.5μl上清液，转移到新的200μl的PCR管内，管内移入的上清液即为多重PCR产物；

(3.3)第2轮接头序列PCR反应

在PCR管、排管或PCR板内按下表配方配制反应液，用枪轻柔地上下吹吸混匀，其中，PCRproduct mixture为步骤(3.2.10)获得的纯化后的多重PCR产物；

运行PCR仪，放入上述PCR管、排管或PCR板，按下列程序进行反应：先95℃210s，之后执行循环程序：98℃20s、68℃1min、72℃30s循环9次，最后72℃延伸5min；

(3.4)第2轮磁珠纯化

(3.4.1)取30ul步骤(3.3)处理的PCR反应体系，并加27ul室温平衡后的AMPure XP磁珠，用移液器吸打混匀20次；

(3.4.2)室温孵育5min后，将PCR管置于DynaMag-96Side磁力架上3min；

(3.4.3)彻底移除上清，将PCR管从磁力架取下，向管内加入50ul YF buffer B并用移液器吸打混匀20次；

(3.4.4)室温孵育5min后，将PCR管置于DynaMag-96Side磁力架上3min；

(3.4.5)移除上清，PCR管继续放置在磁力架上，向管内加入180ul体积百分数为80％乙醇溶液，静置30s；

(3.4.6)移除上清，PCR管继续放置在磁力架上，向管内加入180ul体积百分数为80％乙醇溶液，静置30s后彻底移除上清；

(3.4.7)室温静置3min，使残留乙醇彻底挥发；

(3.4.8)将PCR管从磁力架取下，加入24μl Nuclease-free water或者1×TE buffer(pH8.0)，用移液器轻轻吸打混匀20次，重悬磁珠，避免产生气泡，室温静置2min；

(3.4.9)将PCR管重新置于磁力架上，静置3min；

(3.4.10)用移液器吸取20μl上清液，转移到新的200μl的PCR管内，管内移入的上清液即为制备好的多重PCR文库；

(3.5)文库定量

取2ul步骤(3.4.10)获得的多重PCR文库，并使用3.0 Fluorometer(QubitdsDNA HS Assay Kit)进行文库浓度测定，记录文库浓度；唾液gDNA或血液gDNA所构正常文库的浓度范围为5-40ng/ul；

(4)上机测序

将步骤(3.5)获得的多重PCR文库使用Hiseq Xten PE150进行测序获得基因序列表，上机数据量为150Mb；

(5)数据分析注释：测序数据下机后，对下机数据进行生物信息学分析，检测基因上的变异；

(5.1)下机数据Fastq格式质量控制：对每个样本文库和lane产生的每对原始Fastq序列raw reads，使用软件cutAdapt去除测序接头和包含大量‘N’碱基的序列reads，得到满足质控的序列Clean reads，使用软件fastqc统序列计Clean reads基本信息，包括序列和碱基数量、GC含量和分布、测序错误率和分布、碱基质量分布；

(5.2)比对Alignment：使用软件bwa，把序列Clean reads与人类参考基因组GRCh38比对，得到序列Clean reads在参考基因组上的比对信息文件BAM；

(5.3)比对信息文件BAM预处理：使用picard和GATK软件把同一样本不同文库、lane产生的比对信息文件BAM文件合并一起，按照基因组坐标排序，验证比对信息文件BAM文件，去除PCR过程中产生的重复序列，校正碱基质量值，得到预处理后的比对文件Clean BAM；使用picard软件统计比对文件Clean BAM，得到质控信息；所述质控信息包括对目标区域捕获芯片的覆盖度、深度、捕获效率、均一性，可比对序列和碱基的数量，插入片段的长度分布；

(5.4)变异检测：使用GATK软件检测基因上的小片段变异，包括单核苷酸多态性(SNP)和插入、缺失(Indel)；对检测变异进行过滤，SNP过滤条件为：QD3.37||FS31.397||SOR10.419||MQ20.0||MQRankSum-12.49||ReadPosRankSum-3.721，Indel过滤条件为：QD5.2||FS52.254||SOR9.044||ReadPosRankSum-5.504；

对满足过滤条件的变异进行注释，标注出对应的基因、转录本、变异类型、功能、在正常人群中的频率；

统计变异结果，得到变异数量、长度分布、各类型变异数量、人群中出现的比例。