[发明专利]一种基因修饰的外泌体及其制备方法和应用

说明书

本发明提供了一种基因修饰的外泌体及其制备方法和应用，所述外泌体表达具有免疫调节功能的膜蛋白；所述具有免疫调节功能的膜蛋白包括PD‑L1、PD‑L1‑ITGB1融合蛋白、HLA‑G1或HLA‑G5中的任意一种或至少两种的组合。本发明采用含有免疫调节功能基因的腺相关病毒感染间充质干细胞，从间充质干细胞培养上清中分离纯化得到表达PD‑L1、PD‑L1‑ITGB1、HLA‑G1或HLA‑G5的外泌体，所述外泌体具有与间充质干细胞相似的免疫调节功能，对特异性抗原活化的T细胞具有显著的抑制作用，或诱导免疫细胞产生特异性免疫耐受，有效克服了间充质干细胞治疗的缺陷。

技术领域

本发明属于基因工程和生物工程技术领域，涉及一种基因修饰的外泌体及其制备方法和应用，尤其涉及一种间充质干细胞来源的基因修饰的外泌体及其制备方法和在制备免疫排斥疾病预防药物和/或治疗药物中的应用。

背景技术

间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)是一种多能干细胞，能够分化为多种细胞，如心肌细胞、脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞和神经细胞等。临床上间充质干细胞主要来源于骨髓和婴儿脐带。在正常生理状态下，间充质干细胞经过外周血循环到达身体的损伤部位，经局部环境诱导分化成为组织细胞，达到修复组织损伤的目的。间充质干细胞还具有强大的免疫调节功能，目前已在临床上应用于预防和治疗造血干细胞移植过程中的移植物抗宿主病(graft versus host disease，GVHD)。研究发现，间充质干细胞主要通过分泌免疫抑制性细胞因子、抑制免疫细胞接触等方式来调节免疫反应。另有研究发现，间充质干细胞与糖皮质激素共用会降低糖皮质激素对免疫反应的抑制作用，因此，间充质干细胞的主要功能是免疫调节而不是单纯的免疫抑制。

移植物抗宿主病(GVHD)是一种常见的同种异基因干细胞移植并发症，其发生机制是：供者干细胞中的T细胞识别受者蛋白并且将其认为外来抗原，启动移植物抗宿主反应。GVHD的发生曾经被认为需要以下三个条件：移植物中含有免疫活性的细胞；受者的免疫系统被破坏，对移植物无反应；受者有供者不表达的抗原。然而，根据目前对GVHD的认识，即使供者和受者的HLA完全匹配，GVHD也会发生。当GVHD发生时，供者免疫细胞识别宿主抗原，活化产生大量的炎症因子，改变炎症环境，活化T细胞、NK细胞和巨噬细胞攻击宿主组织，造成组织损伤。GVHD的主要损伤器官包括肝脏、消化道和皮肤等，严重者可危及生命。目前，临床上主要采用向移植后病人输入间充质干细胞的方法，预防和减缓GVHD的症状。

间充质干细胞还可用于治疗炎症相关疾病，如克罗恩病(Crohn’s disease)、帕金森综合症(Parkinson’s Disease)、肝脏移植排斥、肺移植排斥、糖尿病等。虽然上述疾病的发病机制并不相同，但是都有免疫细胞和免疫反应参与其中，间充质干细胞通过发挥免疫调节功能应用于上述疾病的治疗。

根据目前的临床结果，间充质干细胞表现出良好的炎症抑制作用，但是仍然存在不足：(1)间充质干细胞主要来源于婴儿脐带，从脐带分离后进行体外培养，获得的细胞数量有限，限制了大规模临床应用，且不同批次的间充质干细胞的质量和效果存在差异，可控性差；(2)间充质干细胞治疗属于细胞治疗范畴，存在安全性和伦理道德方面的问题。因此，有必要提供新的策略以克服间充质干细胞治疗的缺陷。