[发明专利]一种基因修饰的外泌体及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种基因修饰的外泌体，其特征在于，所述外泌体表达具有免疫调节功能的膜蛋白；

所述具有免疫调节功能的膜蛋白包括PD-L1、PD-L1-ITGB1、HLA-G1或HLA-G5中的任意一种或至少两种的组合。

2.根据权利要求1所述的外泌体，其特征在于，所述PD-L1包括SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:5具有80％以上同一性、且具有相同或相似生物功能的氨基酸序列；

优选地，所述PD-L1-ITGB1包括SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:6具有80％以上同一性、且具有相同或相似生物功能的氨基酸序列；

优选地，所述HLA-G1包括SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:7具有80％以上同一性、且具有相同或相似生物功能的氨基酸序列；

优选地，所述HLA-G5包括SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:8具有80％以上同一性、且具有相同或相似生物功能的氨基酸序列。

3.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体为含有具有免疫调节功能的膜蛋白的编码基因的腺相关病毒载体；

优选地，所述表达载体包括编码PD-L1的核酸分子、编码PD-L1-ITGB1的核酸分子、编码HLA-G1的核酸分子或编码HLA-G5的核酸分子；

优选地，所述编码PD-L1的核酸分子包括SEQ ID NO:1所示的核酸序列；

优选地，所述编码PD-L1-ITGB1的核酸分子包括SEQ ID NO:2所示的核酸序列；

优选地，所述编码HLA-G1的核酸分子包括SEQ ID NO:3所示的核酸序列；

优选地，所述编码HLA-G5的核酸分子包括SEQ ID NO:4所示的核酸序列。

4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述腺相关病毒载体包括AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9或AAV10中的任意一种，优选为AAV2或AAV2/YF3。

5.一种重组腺相关病毒，其特征在于，所述重组腺相关病毒为转染有权利要求3或4所述的表达载体和辅助质粒的哺乳细胞。

6.一种权利要求5所述的重组腺相关病毒的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)将权利要求3或4所述的表达载体与辅助质粒和转染试剂共转染哺乳细胞，培养一段时间后进行细胞裂解；

(2)将细胞裂解液加入氯化铯溶液中进行超速离心，收集含有腺相关病毒的氯化铯溶液；

(3)将含有腺相关病毒的氯化铯溶液进行透析处理，得到所述腺相关病毒。

7.一种权利要求1或2所述的外泌体的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

采用权利要求5所述的重组腺相关病毒感染间充质干细胞，培养一段时间后，收集间充质干细胞的培养上清；

从所述间充质干细胞的培养上清中分离纯化得到所述外泌体。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述重组腺相关病毒感染间充质干细胞的MOI为5000～10000；

优选地，所述间充质干细胞的培养基为无血清、无外泌体培养基；

优选地，所述间充质干细胞的培养时间不短于3天；

优选地，所述外泌体的分离纯化方法包括超速离心法和/或聚乙二醇沉淀法。

9.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求1或2所述的外泌体；

优选地，所述药物组合物还包括间充质干细胞；

优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂中的任意一种或至少两种的组合。

10.一种权利要求1或2所述的外泌体、权利要求3或4所述的表达载体、权利要求5所述的重组腺相关病毒或权利要求9所述的药物组合物在制备免疫排斥疾病预防药物和/或治疗药物中的应用；

优选地，所述免疫排斥疾病包括移植物抗宿主病。