[发明专利]一种具有毛囊再生功能的人体外分泌腺干细胞提取方法

说明书

本公开公开一种具有毛囊再生功能的人体外分泌腺干细胞提取方法,其特征在于，包括以下步骤：取人类外分泌腺组织，冲洗，剪碎；剪碎的组织用一型胶原酶将外分泌腺组织消化；收集消化细胞，得到单细胞悬液；培养细胞；得到细胞悬液，按细胞悬液∶分离液体积比为2∶1的比例将细胞悬液加入到所述的干细胞分离液中；离心机离心；吸取富含有核细胞的中间细胞层；将获取的单个核细胞加入到含10％小牛血清的高糖DMEM培养基中，连续培养；用浓度为10μg/ml的纤连蛋白溶液筛选干细胞，该方法提取的细胞量大、存活率高、更易于在培养瓶内贴壁、细胞活性好。

技术领域

本公开属于生物细胞领域，具体涉及一种具有毛囊再生功能的人体外分泌腺干细胞提取方法。

背景技术

分泌腺有内分泌腺和外分泌腺两大类,两者之间的区别主要在于内分泌腺无排泄管，腺细胞排列缺乏极性，多聚集成团块状或索状。内分泌腺分泌的分泌物称激素。其分泌物直接进入细胞周围的血管和淋巴，由血液和淋巴输送到各组织或器官中。而外分泌腺有排泄管，称腺导管，其分泌物通过腺导管输送到相应的组织或器官发挥其调节作用；

目前以人体外分泌腺干细胞提取方法主要为机械酶解法和传统灌洗法两种。机械酶解法虽然能获取数量较多的细胞，但其中的人体外分泌腺干细胞含量较低，同时很难避免胎盘中母源性细胞的干扰。传统灌洗法整个提取过程操作繁复、耗时长、成本高，提取出来的细胞活率相对较低。

发明内容

针对现有技术的不足，本公开的目的在于提供一种具有毛囊再生功能的人体外分泌腺干细胞提取方法，解决了现有技术中人体外分泌腺干细胞在提取过程中细胞活性不稳定，细胞存活率低、细胞数低的问题。

本公开的目的可以通过以下技术方案实现：

一种具有毛囊再生功能的人体外分泌腺干细胞提取方法,包括以下步骤：

1)取人类外分泌腺组织，冲洗，剪碎；

2)剪碎的组织用一型胶原酶将外分泌腺组织消化；

3)收集消化细胞，得到单细胞悬液；

4)培养细胞，传代5次；

5)将培养细胞加入磷酸盐缓冲液PBS中轻匀，得到细胞悬液，按细胞悬液∶分离液体积比为2∶1的比例将细胞悬液加入到所述的干细胞分离液中；

6)常温离心机中以1500r/min进行密度梯度离心15分钟；

7)小心吸取富含有核细胞的中间细胞层；

8)将获取的单个核细胞加入到含10％小牛血清的高糖DMEM培养基中，接种于培养瓶内中，在37℃、5％CO2孵育箱连续培养；

9)用浓度为10μg/ml的纤连蛋白溶液筛选干细胞。

进一步地，所述分离液按重量份数包括以下组分：

泛影葡胺：3-8份，

羟甲基纤维素：3-10份，

氯化铯：0.01-1.0份，

聚蔗糖：0.01-10份；

聚乙二醇:0.01-8份

将上述成分混合，加入0.01mol/L磷酸盐缓冲液配成所述的干细胞分离液的浓缩液；将所述的浓缩液用0.01mol/L磷酸盐缓冲液稀释至所需的比重，比重范围为1.090-1.120g/ml。

进一步地，所述人类外分泌腺组织，采用无菌PBS反复冲洗人类外分泌腺组织直至其无血液。