[发明专利]一种具有毛囊再生功能的人体外分泌腺干细胞提取方法

权利要求书

1.一种具有毛囊再生功能的人体外分泌腺干细胞提取方法,其特征在于，包括以下步骤：

1)取人类外分泌腺组织，冲洗，剪碎；

2)剪碎的组织用一型胶原酶将外分泌腺组织消化；

3)收集消化细胞，得到单细胞悬液；

4)培养细胞，传代3-5次；

5)将培养细胞加入磷酸盐缓冲液PBS中轻匀，得到细胞悬液，按细胞悬液∶分离液体积比为2∶1的比例将细胞悬液加入到所述的干细胞分离液中；

6)常温离心机中以1500r/min进行密度梯度离心15分钟；

7)小心吸取富含有核细胞的中间细胞层；

8)将获取的单个核细胞加入到含10％小牛血清的高糖DMEM培养基中，接种于培养瓶内中，在37℃、5％CO2孵育箱连续培养；

9)用浓度为10μg/ml的纤连蛋白溶液筛选干细胞。

2.根据权利要求1所述的干细胞分离液，其特征在于，所述分离液按重量份数包括以下组分：

泛影葡胺：3-8份，

羟甲基纤维素：3-10份，

氯化铯：0.01-1.0份，

聚蔗糖：0.01-10份；

聚乙二醇:0.01-8份

将上述成分混合，加入0.01mol/L磷酸盐缓冲液配成所述的干细胞分离液的浓缩液；将所述的浓缩液用0.01mol/L磷酸盐缓冲液稀释至所需的比重，比重范围为1.090-1.120g/ml。

3.根据权利要求2所述的一种具有毛囊再生功能的人体外分泌腺干细胞提取方法，其特征在于，所述人类外分泌腺组织，采用无菌PBS反复冲洗人类外分泌腺组织直至其无血液。

4.根据权利要求3所述的一种具有毛囊再生功能的人体外分泌腺干细胞提取方法，其特征在于，所述筛选的方法是，用纤连蛋白PBS溶液覆盖容器底部，4℃放置，12小时后吸去液体，用人间充质干细胞完全培养基清洗容器，吸去培养基，得到融合率已达80％的第五代细胞制得的单细胞悬液，将单细胞悬液放入纤连蛋白铺被的容器中，37℃恒温，30分钟后吸去液体，再加入人间充质干细胞完全培养基，附着在铺被有纤连蛋白的容器底部的细胞即为人体外分泌腺干细胞。

5.根据权利要求4所述的一种具有毛囊再生功能的人体外分泌腺干细胞提取方法，其特征在于，所述人体外分泌腺干细胞置于-196℃的液氮中进行保存。

6.根据权利要求5所述的一种具有毛囊再生功能的人体外分泌腺干细胞提取方法，其特征在于，所述培养是将单细胞悬液在37℃二氧化碳浓度5％条件下，人间充质干细胞完全培养基培养，至细胞融合达70～80％后，传代五次。

7.根据权利要求6所述的一种具有毛囊再生功能的人体外分泌腺干细胞提取方法，其特征在于，所述传代的每次传代的方法是：

(1)细胞清洗：将待传代的人体外分泌腺干细胞在无菌环境下取出，用缓冲液润洗2～4次；

(2)细胞分割：人体外分泌腺干细胞分为多份小块；

(3)接种：加入人体充质干细胞完全培养基终止消化，离心5分钟，弃上清液；

(4)培养：立即用无菌透明胶带封闭，放入温度为36～38℃，湿度为60～80％的培养箱中继续孵育。