[发明专利]兼抗黄瓜花叶病毒和马铃薯X病毒的双联弱毒疫苗及其应用

说明书

本发明公开了一种兼抗黄瓜花叶病毒和马铃薯X病毒的双联弱毒疫苗及其应用，所述双联弱毒疫苗为插入有PVX基因片段的黄瓜花叶病毒RNA2弱毒突变型质粒载体pCC_FR2‑2bPTⅡ‑PX_1967‑2166；所述PVX基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述双联弱毒疫苗的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明的双联弱毒疫苗对CMV和PVX具有交叉保护效果；为田间防治CMV和PVX引起的植物病毒病提供了疫苗材料和有效防治措施。

技术领域

本发明涉及植物病毒学和分子生物学技术领域，具体涉及一种兼抗黄瓜花叶病毒和马铃薯X病毒的双联弱毒疫苗及其应用。

背景技术

病毒病是仅次于真菌病的第二大类植物病害，对绝大部分作物均造成不同程度的危害，植物病毒病的防治是研究热点及难点问题。黄瓜花叶病毒(Cucumer mosaic virus，CMV)是目前已知的寄主范围最广的植物病毒之一，可侵染100多科1200多种植物，造成多种具有重要经济价值的植物(农作物、园艺作物等)出现黄化、矮化、畸形等症状，严重影响其产量和品质(Mochizuki et al.,2012)。马铃薯X病毒(Potato virusX，PVX)寄主范围广泛，可侵染16科240种植物，茄科植物是主要的寄主，初侵染的叶片通常表现为坏死斑，之后发展为坏死斑驳、褪绿、花叶或脉褪绿，造成植物严重减产(陈虞超等，2016)。

在自然界中，不同病毒侵染同一寄主植物后有时会加重病毒病的症状，并导致至少一种病毒在植物中的浓度增加，这种现象叫做协生作用。植物病毒协生现象在自然界广泛存在，黄瓜花叶病毒与马铃薯X病毒复合侵染造成的危害更大，因此，设计能够同时抗多种病毒的策略尤为重要。

对于植物病毒病的防治，最有效的方法是抗病品种的筛选与培育，但其存在育种周期长、抗病品种抗性易丧失等不足。另一种方法是弱毒交叉保护，是利用弱毒突变体侵染，诱导植物自身的免疫系统而防治后期侵染的同样类型强病毒株系；是一种有效的病毒防治策略。弱毒突变体可以是天然存在的，也可以通过分子生物学手段进行人工制备。

对于通过分子生物学手段人工制备的双联弱毒疫苗，由于其在构建时需要插入异源病毒的片段，既要插入一定长度的异源病毒片段以保证潜在的基因沉默对异源病毒的防治效果，同时还要保证弱毒突变体的稳定性(即在插入异源病毒片段后的稳定存在)，因此，相对于抗单独病毒的弱毒疫苗，双联弱毒疫苗的构建难度更大。而以黄瓜花叶病毒为基础载体，能够兼抗黄瓜花叶病毒和马铃薯X病毒的双联弱毒疫苗目前还未见有报道。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种兼抗黄瓜花叶病毒和马铃薯X病毒的双联弱毒疫苗。本发明的双联弱毒疫苗对CMV和PVX具有交叉保护效果；为田间防治CMV和PVX引起的植物病毒病提供了疫苗材料和有效防治措施。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供一种兼抗黄瓜花叶病毒和马铃薯X病毒的双联弱毒疫苗，所述双联弱毒疫苗为插入有PVX基因片段的黄瓜花叶病毒RNA2弱毒突变型质粒载体；所述PVX基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述双联弱毒疫苗的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。

本发明的第二方面，提供上述双联弱毒疫苗的制备方法，包括以下步骤：

(1)以CMV_Fny RNA2侵染性克隆质粒pCB301-CMV_Fny-R2为模板，利用反向PCR扩增技术获得中间载体pCC_FR2-2bPTⅡ；所述中间载体pCC_FR2-2bPTⅡ是2661位插入TAATAG，然后再依次引入BamH I、SpeI和Sma I酶切位点；