[发明专利]抗胞囊线虫转基因大豆事件ZHs1-2外源插入片段侧翼序列及其应用

说明书

本发明属于植物生物技术领域，具体涉及一种抗胞囊线虫转基因大豆事件ZHs1‑2外源插入片段侧翼序列及其应用。本发明公开了一种抗胞囊线虫转基因大豆事件ZHs1‑2外源插入片段侧翼，左边界侧翼的500bp如SEQ ID NO:1所述；右边界侧翼的500bp如SEQ ID NO:2所述。提取转基因大豆事件ZHs1‑2基因组DNA，利用基因组重测序技术分析确定外源片段插入位点，并通过PCR扩增获得。其用途是检测待测样品是否含有来源于ZHs1‑2的成分。

技术领域

本发明属于植物生物技术领域，具体涉及一种抗胞囊线虫转基因大豆事件ZHs1-2外源插入片段侧翼序列及其应用。

背景技术

转基因植株特异性转化事件的检测，依赖于外源基因插入位点旁侧序列分析，根据已知的旁侧序列，设计相应的引物进行。因此，明确T-DNA插入位点的信息对相关研究的顺利开展非常重要。在转基因生产应用中，外源基因的插入位点是每份基因转化事件的标签，转化事件的筛选鉴定、转化事件的安全性评价、环境释放申请等都要求提供每份基因转化事件的T-DNA插入位点和插入基因的旁侧序列。

目前获取T-DNA插入位点旁侧序列的方法有很多，根据原理可以分为3类：反向PCR，外源接头介导PCR，半随机引物PCR(如Tail-PCR)。另外，其他方法如质粒拯救法(plasmid rescue)、PCR-walking法等，都已经被广泛用于插入位点的鉴定及侧翼序列的获取。但是，这些方法除了操作步骤复杂、消耗时间长等缺点外，还具有很大的不确定性，特异性比较差，无法获得很高的成功率。

近年来，随着测序技术的不断发展，全基因组重测序技术渐趋成熟。全基因组重测序的时间与成本大幅度下降，使得全基因组重测序的应用越来越广泛，除了用于测定不同物种全基因组序列、构建全基因组图谱外，还被用于突变体基因克隆和插入位点旁侧序列分析等方面。

转基因大豆事件ZHs1-2是利用农杆菌介导法将外源Hs1^pro-1基因导入栽培大豆品种天隆一号中获得的。ZHs1-2转化载体为pHs1，结构图谱如图1所示。该载体含有为Hs1^pro-1基因277bp～1122bp之间一个开放阅读框架，共846bp，另外含有编码膦丝菌素乙酰转移酶基因即BAR基因，作为筛选标记基因，表现为对除草剂草丁膦的抗性，所用的农杆菌菌株为EHA105。所述转化载体pHs1和转基因大豆事件ZHs1-2均由浙江大学作物科学研究所2013年硕士生李红艳完成，关于载体构建和转化事件的获得详见李红艳撰写的硕士论文《抗胞囊线虫转基因大豆种质创新研究》(2013)中。

发明内容

本发明要解决的问题是提供一种抗胞囊线虫转基因大豆事件ZHs1-2外源插入片段侧翼序列及其应用。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种抗胞囊线虫转基因大豆事件ZHs1-2外源插入片段侧翼，左边界侧翼的500bp如SEQ ID NO:1所述；右边界侧翼的500bp如SEQ ID NO:2所述。

作为本发明的抗胞囊线虫转基因大豆事件ZHs1-2外源插入片段侧翼的改进：由来源于大豆基因组序列和来源于外源插入片段序列组成的DNA序列，如SEQ ID NO:5所述；

所述SEQ ID NO:5第1-500位点序列来源于栽培大豆天隆一号基因组序列(SEQ IDNO:1)，第501-5476位点序列来源于外源T-DNA插入片段序列，第5477-5976位点序列来源于栽培大豆天隆一号基因组序列(SEQ ID NO:2)；

因此，SEQ ID NO:5为外源插入片段及插入片段左侧和右侧侧翼序列，共5976bp；SEQ ID NO:1是外源T-DNA插入到大豆基因组中左侧的大豆基因组侧翼序列，第501-5476位点序列为外源插入到大豆基因组中的T-DNA序列；SEQ ID NO:2为T-DNA插入位点右侧的大豆侧翼序列，即第5477-5976位点序列。