[发明专利]一种高效三联检测中华鳖三种病原的LAMP引物及试剂盒

说明书

本发明公开了一种高效三联检测中华鳖三种病原的LAMP引物及试剂盒，包括微流控芯片检测用反应体系，所述微流控芯片检测用反应体系包括检测TSHSV的引物、检测TSFV的引物、检测SYJ15的引物，以及反应液；检测TSHSV的引物、检测TSFV的引物、检测SYJ15的引物分别预埋于微流控芯片上。本发明可以快速、准确的同时检测TSHSV，TSFV和SYJ15。

技术领域

本发明涉及病原菌检测技术领域，特别涉及一种高效三联检测中华鳖三种病原的LAMP引物及试剂盒。

背景技术

中华鳖(Trionyx sinensis)俗称甲鱼、水鱼或团鱼，分类学上隶属爬行纲(Reprilia)、龟鳖目(Chelonia)、鳖科(Trionychidae)、鳖属(Triomx))，主要分布于中国、俄罗斯、日本、越南及其他东南亚等国家和地区，多栖息于江河、湖泊、塘、水库等水流平缓、鱼虾繁生的淡水水域。我国鳖病的研究起步相对较晚，上世纪80年代初期几乎没有开展相关的研究工作。随着集约化养鳖的迅速发展，鳖病的发生率和死亡率迅速上升，对养殖业造成巨大冲击，鳖病及其治疗的相关研究工作相继开展。中华鳖病具有易受环境因素影响、潜伏期长、病程长、继发感染普遍、并发症多和治愈困难等特点，其发病原因是致病病原、环境条件、中华鳖本身三者之间相互作用的结果。迄今，已经报道的中华鳖疾病有30多种，有腐皮病、红脖子病、红底板病、疥疮症、中华鳖腮腺炎病、中华鳖出血病、白斑病、水霉病、钟形虫病，锥形虫病、氨中毒症、脂肪代谢不良等。申请人近几年的研究表明，目前对中华鳖养殖危害最大的主要有中华鳖鳃腺炎(又包括病毒性和细菌性鳃腺炎)和中华鳖黄病毒病，相应的3种病原分别为病毒TSHSV(病毒性鳃腺炎病原)，中华鳖高致病性蜡样芽孢杆菌SYJ15(细菌性鳃腺炎病原)和TSFV(中华鳖黄病毒病病原)。建立3种病原的快速分子诊断检测技术，是中华鳖主要病害防控的重要技术支撑。目前病原分子诊断采用的技术主要是PCR技术，但由于其反应要在2个不同的温度区循环，对仪器要求高，成本也相对高昂，并且PCR技术仅1对扩增引物，易受干扰，特异性相对不足，且出结果时间较久，操作专业要求高，微量加量步骤多。并且多种致病因逐一检测，耗时久，操作繁琐，且浪费试剂。近年来发展起来的LAMP技术共有4条不同的特异性引物，故而检测结果准确度更高，但是由于是恒温反应，缺少类似PCR的热启动酶，在设备升温阶段容易产生非特异性扩增从而影响检测结果。

微流控芯片技术是通过生物学、化学、医学、电子、材料、机械等多学科交叉，将分子生物学、化学分析、医学等领域所涉及的样品前处理、分离及检测等过程集成到几平方厘米的芯片上，从而实现分析的微型化、自动化、集成化和便携化的技术，具有样品消耗少、检测速度快、操作简便、多功能集成、体积小和便于携带等优点，已在多个领域得到应用。此外，因其体积小巧、操作简单，极大地拓展了体外诊断的应用空间。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高效三联检测中华鳖三种病原的LAMP引物及试剂盒。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种高效三联检测中华鳖三种病原的LAMP引物，包括检测TSHSV的引物、检测TSFV的引物和检测SYJ15的引物；

检测TSHSV的引物包括：

外引物

TSHSV-F3：5’-ACCACACCTAAACTTAAACCT-3’(SEQ ID No.1)；

TSHSV-B3：5’-GAATCCTTTATTGGGCCTTAC-3’(SEQ ID No.2)；

内引物

TSHSV-FIP：5’-CCTTTTCGCGGAACTGAGGGGTACTTGGACTTTGAATTCGC-3’(SEQ IDNo.3)；

TSHSV-BIP：5’-TTGCAGGAATGTTCCAGTGTACTCAAATTGGGCTGGTTGT-3’(SEQ IDNo.4)；