[发明专利]一种利用层生镰刀菌发酵转化黄芪甲苷制备环黄芪醇的方法

说明书

本发明涉及一种利用层生镰刀菌(Fusarium proliferatum 0821 CGMCC No.16482)发酵转化黄芪甲苷制备环黄芪醇的方法。本发明利用筛选出的Fusarium proliferatum，以黄芪甲苷为底物，通过发酵，制得环黄芪醇。本发明利用Fusarium proliferatum发酵技术转化黄芪甲苷得到高纯度的环黄芪醇，整个工艺过程在常温、常压下进行，所要求的设备条件低，适用于大批量生产，最终环黄芪醇的转化率达到80％以上、纯度高达95％以上。

技术领域

本发明属于医药化工领域，具体涉及一种利用层生镰刀菌发酵转化黄芪甲苷制备环黄芪醇的方法。

背景技术

黄芪是中医临床治疗最常用的药物之一。黄芪中的有效成分包括黄酮类、皂苷类、多糖类及氨基酸类。黄芪甲苷是黄芪皂苷的代表性化合物，具有提高免疫力、清除自由基、降压以及抗菌等多种功效。而环黄芪醇是黄芪皂苷的苷元，分子式为C30H5OO5、相对分子质量为490.71，是黄芪甲苷在肠道内代谢的主要产物，具有促进伤口愈合，促进神经细胞增殖，抗衰老等作用。而且研究发现，环黄芪醇能够起到激活端粒酶的作用，有效抑制端粒的减少，从而增强机体免疫力，抗衰老。

环黄芪醇为黄芪皂苷的苷元，主要由黄芪甲苷水解得到，易溶于甲醇、乙酸乙酯等。目前水解黄芪甲苷制备环黄芪醇的生产工艺主要为化学法、酶法及微生物发酵法。

化学法是通过强氧化剂水解断开黄芪甲苷C3位置的木糖苷键和C6位置的葡萄糖苷键为得到环黄芪醇。中国发明专利CN104817610A使用硫酸水解黄芪甲苷制备环黄芪醇，反应器为一种高压反应釜，水解温度为130℃。硫酸水解反应条件剧烈，导致黄芪甲苷的三元环破坏严重，产生大量副产物。

酶法是采用多种水解酶复合的形式水解黄芪甲苷制备环黄芪醇。中国发明专利CN105734109A使用β-葡萄糖苷酶、油柑酶、纤维素酶、蜗牛酶的复合酶组合，使用复合酶的缺点是酶的成本较大，不易大规模生产。

微生物发酵法是中国发明专利CN106011213A使用犁头霉发酵水解黄芪甲苷制备环黄芪醇的方法。相较于本发明来说，该方法黄芪甲苷的转化率较低。

发明内容

本发明是利用筛选出的菌种层生镰刀菌(Fusarium proliferatum 0821)(CGMCCNo.16482中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心北京市朝阳区北辰西路1号院3号保藏日期：20180911)，选用合适的培养基并在适当的培养条件下发酵转化黄芪甲苷制备环黄芪醇。本发明的目的在于采用微生物转化的方法来克服现有化学法和酶法制备环黄芪醇技术中副产物多、成本高、污染环境等缺点，并且比现有的微生物发酵制备环黄芪醇的转化率高。

为实现上述发明目的，所采用的技术方案是：

(1)种子培养

将保存的菌种Fusarium proliferatum接入100mL装有麦芽汁培养基的锥形瓶中，在25-30℃、150-200r/min的条件下培养36-48h，获得种子液。

(2)转化培养

将步骤(1)培养的种子液按10％的接种量接入100mL装有发酵培养基的锥形瓶中，在25-30℃、150-200r/min的条件下培养6天，获得发酵液。

(3)分离纯化

将步骤(2)所得的发酵液经水饱和正丁醇等体积萃取三次后真空浓缩蒸干得到萃取产品，进一步利用硅胶柱层析分离纯化，最终通过乙醇重结晶将产品的纯度提高到95％以上，得到环黄芪醇产品。

上述步骤(2)中的发酵培养基的组成为：黄芪粉2g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉2g/L，K2HPO4 1g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，黄芪甲苷底物0.2g/L。