[发明专利]用于表达Agrin蛋白的重组质粒及其构建方法和应用

说明书

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及用于表达Agrin蛋白的重组质粒及其构建方法和应用。本发明通过重叠延伸RT‑PCR获得Agrin全长基因片段，重组至真核表达质粒上，从而可以高效地在真核细胞中表达Agrin蛋白，并且以上述表达的Agrin蛋白作为抗原与血清中的Agrin抗体进行高效结合，所使用试剂均为常规试剂，检测成本较低，并且有助于重症肌无力致病机制研究的开展并且具有作为疾病生物标志物的潜在功能，为后续辅助患者精准诊疗提供指导。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及用于表达Agrin蛋白的重组质粒及其构建方法和应用。

背景技术

聚集蛋白(Agrin)是神经元衍生的肝素-硫酸盐蛋白聚糖，为运动神经末梢合成和释放的细胞外基质蛋白，同时也是LRP4和MuSK相互作用的调节者，二者通过其产生结合力，人源基因定位于染色体1p36.33，Agrin蛋白分子量为217kDa，存在6个转录本和5种蛋白质变体。Agrin蛋白含有9个卵泡抑素样结构域，4个表皮细胞生长因子(EGF)样结构域，中心含有1个层粘连蛋白β样结构域和3个层粘连蛋白G(LG)样结构域，还含有1个富含丝苏氨酸的结构域。Agrin基因通过不同的剪切模式，分为神经型Agrin(N-Agrin)和肌肉型Agrin(M-Agrin)这两种具有组织表达特异性的不同亚型。具有4个AA插入片段的同工型(y+)和具有8个AA插入片段的(z+8)同工型都是神经元特异性的Agrin基因。

重症肌无力(Myasthenia gravis，MG)是一种由自身抗体介导的神经-肌肉接头传递功能障碍的获得性自身免疫性疾病，表现为肌无力和易疲劳。从运动神经元末梢释放的N-Agrin与跨膜蛋白低密度脂蛋白受体相关蛋白4(LRP4)结合，激活肌肉特异性受体酪氨酸激酶(MuSK)使其磷酸化，诱导烟碱型乙酰胆碱受体(n-AChR)在肌细胞膜上聚集表达，对调节神经肌肉接头(NMJ)的形成、维持及再生具有重要作用。少数MG病人Agrin抗体的存在可导致神经肌肉传递障碍。作为一种致病性抗体，Agrin抗体阳性的MG患者临床特征及治疗预后还不明确，Agrin抗体的检测将大幅提高MG实验诊断的灵敏度和特异性，对MG的诊断、治疗以及预后具有重要指导意义。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了用于表达Agrin蛋白的重组质粒及其构建方法和应用，目的是为了解决现有技术中无法准确获取神经型Agrin，以及还没有可以在真核细胞中表达Agrin蛋白的质粒，因此无法高灵敏度和强特异性与Agrin抗体结合，从而无法有效应用于实验诊断中的技术问题。

本发明提供的用于表达Agrin蛋白的重组质粒，具体技术方案如下：

用于表达Agrin蛋白的重组质粒，包括载体质粒，所述载体质粒上重组连接有Agrin蛋白编码基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述载体质粒为真核表达质粒，所述载体质粒还携带有荧光报告基因。

在某些实施方式中，所述荧光报告基因为GFP标签蛋白基因。

本发明还提供了上述用于表达Agrin蛋白的重组质粒的构建方法，包括如下步骤：

S1，抽提人组织中的总RNA经过逆转录，获得cDNA；按照SEQ ID NO.1所示的序列，加入酶切位点，设计引物1和引物2；按照序列SEQ ID NO.1的5658位点设计正反向重叠的引物3和引物4；以所述cDNA为模板，利用引物1、引物2、引物3和引物4进行重叠延伸RT-PCR，获得重叠延伸RT-PCR产物；

S2，对步骤S1中的重叠延伸RT-PCR产物和真核表达质粒分别依据步骤S1中的酶切位点进行双酶切，获得Agrin目的基因片段和真核表达质粒片段；

S3，将步骤S2中的Agrin目的基因片段与真核表达质粒片段使用T4连接酶进行连接，并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞进行扩大培养，抽提质粒，即为用于表达Agrin蛋白的重组质粒。