[发明专利]一种低病毒用量的CAR-T制备方法在审
| 申请号： | 202011176230.5 | 申请日： | 2020-10-29 |
| 公开（公告）号： | CN112251466A | 公开（公告）日： | 2021-01-22 |
| 发明（设计）人： | 于峰详;廉云飞 | 申请（专利权）人： | 江苏拓弘生物科技有限公司 |
| 主分类号： | C12N15/867 | 分类号： | C12N15/867;C12N5/10 |
| 代理公司： | 常州佰业腾飞专利代理事务所(普通合伙) 32231 | 代理人： | 王巍巍 |
| 地址： | 210000 江苏省*** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 病毒 用量 car 制备 方法 | ||
本发明实施例公开了一种低病毒用量的CAR‑T制备方法，涉及免疫学和分子生物学技术领域，是将分选活化得到的CD3+T细胞进行慢病毒转染，所述CD3+T细胞来源于人外周血单核细胞。本发明实施例解决了现有技术中大部分病毒转染CAR‑T技术病毒用量高且转染率比较低的问题，方法简单，重现性好，契合临床需求，具有广泛的应用前景。
技术领域
本发明涉及免疫学和分子生物学技术领域，尤其涉及一种低病毒用量的CAR-T制备方法。
背景技术
过继性免疫细胞治疗是当前生物医药领域新型的抗肿瘤治疗手段。该方法主要通过将患者自体细胞提取后，经体外进行活化，修饰，培养和扩增后，再回输至患者体内，从而到达治疗肿瘤的目的。CAR-T，即嵌合抗原受体修饰性T细胞是一种具有靶向性的过继性免疫细胞治疗方法。该技术通过利用基因修饰的方法改造T细胞基因组，使其表达可识别肿瘤特异性抗原的CAR受体，进而突破原始T细胞抗肿瘤的MHC限制性，使T细胞直接杀伤肿瘤。例如CD19特异性CAR-T细胞已经在急性B淋巴细胞白血病和B细胞淋巴瘤的治疗方面取得了突破性进展，并实现了临床应用。但是目前的病毒转染CAR-T技术依旧面临着诸多挑战，目前大部分病毒转染CAR-T技术依旧是病毒用量高且转染率比较低。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术中病毒转染CAR-T技术依旧是病毒用量高且转染率比较低的技术问题，提供一种低病毒用量的CAR-T制备方法。
本发明提供的技术方案如下：
一种低病毒用量的CAR-T制备方法，其特征在于，是将分选活化得到的CD3+T细胞进行慢病毒转染。
优选的，所述CD3+T细胞来源于人外周血单核细胞。
优选的，所述外周血单核细胞已进行冻存处理。
一种低病毒用量的CAR-T制备方法，包括如下步骤：
Day 1，进行冻存外周血单核细胞的复苏；
Day 2，所述外周血单核细胞复苏一日后，进行CD3+T细胞的分选活化，磁珠与T细胞共孵育进行激活；
Day 3，取沉降的细胞团离心，重悬后通过添加转染剂进行慢病毒转染；
Day 4，转染过夜后，离心除去含转染试剂及病毒的培养基，添加新鲜培养基重悬并计数，调整细胞密度调整并继续培养；
Day 5，更换新鲜培养基，维持细胞密度，继续培养2天。
Day 7，各组细胞计数，更换培养基继续培养，取样检测。
优选的，步骤Day 2中所述磁珠用量为2E+07，细胞密度维持3.1E+06/ml。
优选的，所述步骤Day 3所述转染剂的为聚合阳离子转染试剂，用量为8ug/ml。
优选的，所述聚合阳离子转染试剂为Ploybrene转染试剂。
优选的，所述聚合阳离子转染试剂为HitransG病毒转染试剂。
优选的，所述步骤Day4和Day5中所述细胞密度为1.0E+06/ml。
优选的，所述细胞数均为活细胞数。
通过采用上述技术方案，达到的技术效果如下：
本发明方法简单，利用较低量的慢病毒量进行转染且转染率较高，节省了病毒的用量且最终阳性率较高。
附图说明
图1是实施例1的转染阳性率结果图；
图2是实施例2的转染阳性率结果图；
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