[发明专利]一种海藻多糖免疫调节活性的快速筛选方法及应用

说明书

本发明涉及生物化学技术领域，公开了一种海藻多糖免疫调节活性的快速筛选方法及应用。本发明通过UPLC‑MS/MS方法检测出海藻多糖处理后的巨噬细胞中一种特征代谢物‑瓜氨酸，将其作为快速筛选海藻多糖的免疫调节活性的生物标志物，根据其差异代谢情况筛选海藻多糖的免疫调节活性，并验证了总状蕨藻盾叶变种多糖、裙带菜多糖及孔石莼多糖作用于巨噬细胞的免疫调节活性与瓜氨酸代谢量之间的关联性。本发明的海藻多糖免疫调节活性的快速筛选方法具有快速高效性、无需大量使用化学或生物试剂、环保清洁、易于推广应用等优点，可以为缩短海藻多糖来源的免疫功能食品研发周期提供参考依据。

技术领域

本发明涉及生物化学技术领域，更具体的，涉及一种海藻多糖免疫调节活性的快速筛选方法及应用。

背景技术

多糖是所有生命有机体的重要组分，在控制细胞分裂、调节细胞生长以及维持生命有机体正常代谢等方面具有重要作用。而海藻多糖作为一类良好的免疫调节剂，对大多数细胞都没有明显毒性，海藻多糖能刺激各种免疫活性细胞(如巨噬细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞等)的分化、成熟、繁殖，以及能使机体的免疫系统得到恢复和加强，被公认为是一种重要的生物效应调节剂。

目前海藻多糖体外免疫调节活性的筛选主要是以小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞为研究对象，研究海藻多糖对RAW264.7细胞的毒性作用、吞噬活性的影响，以NO的释放量为主要指标，筛选免疫活性组分多糖，用ELISA试剂盒法测定巨噬细胞的肿瘤坏死因子TNF-α和细胞因子IL-6、IL-1β的释放量等生物指标来评评价，但该方法所用仪器较多，实验步骤繁杂，过程费时且所用试剂盒以及化学或生物溶剂较多，效率低且成本高，不利于海藻多糖研发和应用的快速和广泛推广。

代谢物是生物体表型的基础，能帮助更直观有效地了解生物学过程及其机理。基于对代谢物的定性定量分析，代谢组学可以用于代谢途径或代谢网络的解析，不同生物个体的宏观表型现象的代谢基础研究，以及动物经济性状育种价值评估、疾病诊断预防、动物产品安全性评价和动物医学模型应用。

综上所述，研发一种以细胞代谢物为生物标志物的海藻多糖免疫调节活性的快速筛选方法及其分离培养方法和应用实为必要。

发明内容

本发明所提供的海藻多糖免疫调节活性的快速筛选方法及应用，主要用于解决但该方法所用仪器和试剂较多，实验步骤繁杂，过程费时，效率低且成本高，不利于海藻多糖研发和应用的快速和广泛推广的问题。本发明以巨噬细胞为实验对象，选取不同来源的海藻多糖对齐进行干预处理，进行代谢组学分析，通过检测经海藻多糖干预处理后的巨噬细胞的一种特征代谢物-瓜氨酸，由于瓜氨酸是通过巨噬细胞中一氧化氮合酶(NOS)催化精氨酸生成NO的副产物，将其作为快速筛选海藻多糖的免疫调节活性的生物标志物，通过分析海藻多糖作用于巨噬细胞的免疫调节活性与瓜氨酸的关联性，验证本发明的海藻多糖免疫调节活性的快速筛选方法的可行性和可靠性。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明提供的一种海藻多糖免疫调节活性的快速筛选方法，包括以下步骤：

S1.细胞样本处理：取对数生长期的巨噬细胞，置于完全培养液中，计数并调整细胞悬液浓度至2×10⁶个/mL后，接种至无菌培养皿中，每孔加入1mL，37℃培养20～40小时，中间更换一次培养液，弃上清后用PBS缓冲液清洗2～4次，加入浓度为80～100μg/mL的海藻多糖溶液5～8mL，37℃培养15～20小时；

然后将细胞轻轻吹打成悬浮液，进行细胞计数，并将2×10⁷个细胞转移至离心管中，离心处理后吸出上清液，将收集的细胞用经预冷的PBS缓冲液清洗，并用移液器轻轻吹打，避免剧烈振荡造成细胞破碎，离心处理后，吸干水分并封口，将细胞样本置于液氮中速冻后，再置于-80℃低温保存；