[发明专利]一种基于杂交和级联信号放大原理的多重核酸检测方法及试剂盒

说明书

本发明涉及一种基于杂交和级联信号放大原理的多重核酸检测方法，该检测方法可以对一个样本中的多个目标核酸分子同时进行检测。本发明还涉及与该方法有关的组合物以及试剂盒。本发明通过多组预包被探针、捕获桥接探针实现对目标核酸分子的特异性捕获，并通过标记桥接探针连接级联信号放大系统，实现对样本中目标核酸分子的多重检测，达到检测基因表达水平的目的，从而为阐明疾病发病机理、生物标志物筛查、诊断和预后指示、治疗方案选择等应用提供依据。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别地，涉及一种用于检测和/或定量样本中目标核酸分子的方法、组合物以及试剂盒。该检测方法可以对一个样本中的多个目标核酸分子同时进行检测。

背景技术

特定核酸分子的检测已被广泛应用于疾病或疾病亚型的鉴定、病程监控以及预后评估等。目前核酸检测的常用手段包括：实时荧光定量PCR(qPCR)技术、基因芯片、基因测序等。但这些技术或操作繁琐，或费时费力，或检测成本高，或对样本有较高的要求等。

目前临床医学检验中应用最广的qPCR技术，属于一种模板扩增技术，利用酶促反应进行模板扩增，然后再进行荧光检测过程。该技术对模板完整性要求高，反应受样本中PCR抑制剂影响较为严重，因而对样本类型、样本处理过程有较为严格的限制；另外，受仪器荧光检测通道数量及反应扩增体系中荧光标记的限制，该技术不适用于在一个样本中同时检测大量目标核酸分子。

众所周知，福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)组织样本由其可长期常温保存的特点被全球的医院或组织样本库大量采用，供组织学诊断及研究使用。这些珍贵并来源广泛的医学研究材料为回顾性研究、阐明疾病发病机理、生物标志物筛查、预后指示等提供了宝贵的资源；特别是这些标本的临床结局已得到充分记录，因此对于回顾性研究临床研究而言是最佳选择。然而，FFPE样本中不易留存高品质核酸，即便经过了特殊的核酸提取过程，qPCR技术对FFPE样本中的核酸定量仍然存在准确度低和重现性差的问题。

公开号为CN105087772A的发明专利公开了一种液相基因芯片检测方法，虽然该专利文献提供了一种透过有引物功能的微珠-引物偶联物扩增待检测样本DNA的方法来降低假阳性的风险，但该方法依然需要进行PCR反应，导致产品成本增加，同时存在难以检测少量样本或样本中包含的少量核酸的问题，并且不能够实现对单个样本同时检测多个目标核酸分子。

发明内容

为了解决现有技术进行核酸检测过程中的不足，本发明提供了一种基于杂交和级联信号放大原理的多重核酸检测方法，该方法利用多组可区分的微球，通过多组特异性的探针组合的杂交捕获核酸分子，然后经过级联信号放大，使用已商业化的检测仪器，可以在不进行PCR反应的前提下实现在同一个孔中对单个样本中的多个目标核酸分子进行多重检测，特别适用于大量样本中多个目的基因的高通量检测，并且提供与该方法有关的组合物以及试剂盒。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

在实施方案中，本发明提供一种多重核酸检测方法，包括如下步骤：

1)获得含有目标核酸分子的样本；

2)上述样本与至少一组预包被目标核酸分子特异性探针的微球混合，并加入与目标核酸分子对应的至少一组特异性探针组合，该特异性探针组合包括捕获桥接探针和标记桥接探针；

3)加入至少一组级联信号放大系统，该级联信号放大系统包括初级信号放大分子、次级信号放大分子和信号探针；

检测过程中，目标核酸分子通过上述捕获桥接探针与预包被探针互补杂交，从而固定在微球上；且目标核酸分子通过标记桥接探针与级联信号放大系统相连接；上述信号探针提供待检测信号，进而对目标核酸分子进行检测，通过检测系统检测样本中的目标核酸。

优选地，上述微球带有可分辨标记。

更优选地，上述可分辨标记为条码或荧光染料编码。