[发明专利]一种用于黄鳝生殖干细胞的分离方法及培养基

说明书

本发明涉及一种用于黄鳝生殖干细胞的培养基，包括基础培养基和FBS，所述FBS的浓度为5‑8％；还涉及一种用于分离培养黄鳝生殖干细胞的方法，包括使用上述所述的培养基培养所述黄鳝生殖干细胞的步骤。本发明的培养基可提高黄鳝生殖干细胞的贴壁效率，防止黄鳝生殖干细胞分化，不影响黄鳝生殖干细胞的增殖功能。通过本发明的方法，可使用黄鳝的性腺组织在5天内分离获得纯度较高的黄鳝雌性生殖干细胞和雄性生殖干细胞。得到的生殖干细胞具有典型的干细胞形态，可形成典型的干细胞克隆，碱性磷酸酶染色呈阳性，干细胞相关分子标记也高表达。在将本发明的方法获得的生殖干细胞冻存后，可成功复苏。

技术领域

本发明涉及经济鱼类育种领域，更特别地，涉及一种用于黄鳝生殖干细胞的分离方法及培养基。

背景技术

生殖干细胞是在动物的种系维持中唯一能将遗传物质传递给后代的种子细胞，具有我更新功能和分化多能性。生殖干细胞的研究对动物遗传育种、珍惜物种保护至关重要。

生殖干细胞的分离、诱导分化及相关操作技术成为干细胞研究领域的热点。鱼类干细胞的研究工作起步虽然较晚，但是已经有了长足。目前，国内外学者已经成功建立了多个鱼类的胚胎干细胞系和生殖干细胞系。体外培养获得的虹鳟和青鱂PGC，能够在同源受体性腺移植并成功发育。随后，又建立了一些国内外主要水产经济鱼类的种内和种间生殖细胞的移植技术。这项技术的突破使鱼类的“借腹生子”成为可能。

黄鳝作为我国重要的经济食用鱼类，野生黄鳝被大量毁灭性捕捞，数量日渐减少。因其特殊的生活方式和产卵习性，黄鳝面临着种质资源衰退和优良苗种短缺的严峻问题。传统的黄鳝育种又是一个极其缓慢的过程，因此，如何获得大量优质的黄鳝种苗一直是目前科研工作者亟待解决的问题。肖亚梅等尝试通过分离组织块的方法，培养黄鳝成体性腺组织干细胞，但是该方法培养周期长，且获得的生殖干细胞是一种混合型的细胞。

因此，如何通过优化分离方法和培养体系，建立较为完善的黄鳝类生殖细胞培养体系，是本领域亟待解决的技术难点。

发明内容

为解决以上问题，本发明提供了一种用于黄鳝生殖干细胞的培养基，包括基础培养基和FBS，所述FBS的浓度为5-8％。使用该浓度的FBS可提高黄鳝生殖干细胞的贴壁后的增殖能力，防止黄鳝生殖干细胞分化，不影响黄鳝生殖干细胞的增殖功能。

在一个具体实施方案中，所述基础培养基为RPMI 1640和/或DMEM/F12。尽管本发明在实施例中列举了RPMI 1640为例子对本发明的原理和效果进行展示，但是实现本发明使用的基础培养基还可以用其他培养基，例如DMEM/F12等，只要满足干细胞的基本培养要求即可。在我们的研究中使用DMEM/F12替代RPMI 1640，得到了类似的结果。

在一个优选实施方案中，所述培养基还包括1-5％的KSR和/或1-5％的黄鳝血清。培养基中添加了KSR和黄鳝血清后，有利于多能干细胞干性的维持，生殖干细胞具有更快的增殖速度，并且呈现典型的干细胞形态。

在一个优选实施方案中，所述培养基还包括生长因子。

优选地，所述生长因子为bFGF和/或EGF。bFGF的浓度可为5-15ng/ml，EGF的浓度可为10-30ng/ml。通过添加生长因子，可促进细胞增殖。

在一个优选实施方案中，所述培养基还包括缓冲剂、丙酮酸钠、L-谷氨酰胺和β-巯基乙醇中的一种或多种组合。

在一个具体实施方案中，所述培养基中含有0.5-2mM丙酮酸钠，1-4mM L-谷氨酰胺，10-100μMβ-巯基乙醇，10-20mM Hepes。