[发明专利]重组酶介导等温扩增检测用的引物和探针、试剂盒及应用

说明书

本发明属于重组酶介导等温扩增检测技术领域，公开了一种重组酶介导等温扩增检测用的引物和探针、试剂盒及应用，所述重组酶介导等温扩增检测用的引物和探针的序列为：F1，R2，P；所述重组酶介导等温扩增检测用的引物和探针的合成方法包括：细菌基因组提取；引物探针合成；引物筛选与体系建立。本发明利用实时荧光RAA检测技术，以玉米细菌性枯萎病菌pstS‑glmS序列为模板，设计并筛选荧光性引物探针，构建玉米细菌性枯萎病菌快速检测体系；通过模拟样本及实际样本检测验证，表明本发明特异性强、稳定可靠，对玉米细菌性枯萎病菌的检测限度可达280fg//μL，可用于检疫部门现场快速检测。

技术领域

本发明属于重组酶介导等温扩增检测技术领域，尤其涉及一种重组酶介导等温扩增检测用的引物和探针、试剂盒及应用。

背景技术

玉米细菌性枯萎病菌(Pantoea.stewartii subsp.stewarii，Pss)是我国进境植物检疫性病原物之一，主要分布在美国、加拿大、墨西哥、巴西、秘鲁、意大利、波兰、罗马尼亚、马来西亚、泰国、越南以及俄罗斯、乌克兰等原苏联国家和地区(ESFA，2020)。尽管我国是仅次于美国的世界第二大玉米种植国，但随着国内玉米需求量的激增，自2009年起我国每年都需大量进口玉米。根据海关数据，玉米进口来源主要集中在美国、阿根廷、乌克兰等玉米细菌性枯萎病菌发生国家。随着玉米进口贸易的发展，玉米细菌性枯萎病菌侵入我国风险剧增，该病原物在我国大部分地区气候条件均适合定植，具有广泛的适生区域，一旦入侵将严重威胁我国玉米生产安全(刘翔等，2008)。因此，建立并掌握针对玉米细菌性枯萎病菌快速检测技术至关重要。

目前，针对玉米玉米细菌性枯萎病菌的主要有传统的分离培养(郭翼奋等，1982)，血清学检测(王岭等，2008；Zhao et al.，2014)及常规分子生物学检测技术(王赢等，2009；Tambong et al.，2008)，这些方法或操作复杂、耗时较长，或需大型仪器的支持，无法实现体外恒温条件的快速检测。目前针对体外恒温扩增的技术主要有环介导基因恒温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)、重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymerase amplification，RPA)和重组酶介导等温扩增(recombinase-aided amplification，RAA)技术。LAMP、RPA技术广泛应用于病原微生物及转基因片段的检测研究(李华伟等，2019；董文敏等，2020；谢实龙等，2019)。与LAMP技术利用Bst DNA聚合酶的链置换合成活性提供反应动力，实现目标DNA在恒温条件下的扩增不同(Notomi et al.，2000)，RAA与RPA技术均是利用重组酶与引物DNA结合形成聚合体，实现DNA模板在恒温条件下的的解链，其区别之处在于RPA技术利用噬菌噬uvsX重组酶、单链DNA结合酶(gp32)和uvsY蛋白实现模板DNA解链(Piepenburg O et al.2006)，而RAA技术使用的是从细菌或真菌中获得的重组酶，并在单链DNA结合蛋白(single-stranded DNA binding，SSB)的帮助下，实现模实现模板DNA解链(Lüet al.，2010)。解链后，RPA和RAA均在DNA聚合酶的作用下，快速形成新的互补链，实现了20min内完成特定片段的指数级扩增。

RAA方法耗时短、特异性强、灵敏度高，是目前应用于细菌、病毒、支原体等病原微生物(Zhang et al.，2017；Shen et al.，2019；Xue et al.，2020)检测研究的热门方法之一。

通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：目前针对玉米玉米细菌性枯萎病菌的方法存在操作复杂、耗时较长，或需大型仪器的支持，无法实现体外恒温条件的快速检测。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种重组酶介导等温扩增检测用的引物和探针、试剂盒及应用。