[发明专利]一种斑马鱼骨质疏松模型的构建方法及其应用

说明书

本案涉及一种斑马鱼骨质疏松模型的构建方法及其应用，模型的构建方法主要包括：斑马鱼选取、CdCl₂溶液处理、软骨染色和硬骨染色。与使用泼尼松龙和地塞米松的常规制模方法相比，本发明使用CdCl₂溶液处理斑马鱼可以显著降低斑马鱼的致畸率和致死率；高浓度的CdCl₂溶液处理斑马鱼时，不但显著降低斑马鱼骨骼矿化面积，诱使斑马鱼骨密度显著降低，还引发骨骼发育缺陷，降低骨骼调控相关基因的表达；该方法具有简便、快速、成功率高、重复性好且稳定可靠等优点，能实现定性分析与定量分析；构建的斑马鱼模型具备的骨质疏松的特征更突出、明显，能够快速、高效地用于广泛评价和筛选不同种类的治疗骨质疏松药物的模型。

技术领域

本发明属于生物技术模型构建领域，具体涉及一种斑马鱼骨质疏松模型的构建方法及其应用。

背景技术

骨质疏松症是一种以骨量减少、骨组织显微结构异常和骨折危险性增加为特征的一类病症。该病症是老年人常见病、多发病，随着人口老龄化进程的加快，骨质疏松症的发病率越来越高。因此，构建有效的骨质疏松模型的方法及其应用具有重要意义。

斑马鱼是一种热带鲤科鱼，由于它具有体积小、繁殖周期快、胚胎透明、骨骼发育迅速、与人类相关基因和信号通路有高度同源性等特点，而逐渐被应用于骨骼疾病模型的研究；相对于大鼠和小鼠而言，斑马鱼作为骨质疏松模型更具有优势。

现阶段，构建斑马鱼骨质疏松模型时主要使用的药物是泼尼松龙或地塞米松，但上述两种药物属于糖皮质激素类药物，在造模时极易因为剂量把握不准而使免疫抑制过强导致斑马鱼胚胎致畸、致死率高。目前还有研究发现，高铁也能够造成斑马鱼骨骼发育缺陷，但高铁诱导的幼鱼骨质疏松模型是否能够用于筛选铁螯合剂以外的其他治疗骨质疏松的药物尚未可知。另外，糖皮质激素和铁是人体内调节生理的必需物质，高浓度的这两种化合物对生物体骨之外的生理影响较大。

因此，本领域亟待提出一种能够快速、高效地用于广泛评价和筛选治疗骨质疏松药物的斑马鱼骨质疏松模型构建方法。

发明内容

针对现有技术中的不足之处，本发明旨在提供一种斑马鱼骨质疏松模型的构建方法，其能够用于广谱地筛选各种治疗骨质疏松的药物。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种斑马鱼骨质疏松模型的构建方法，包括以下步骤：

1)将性成熟的斑马鱼按雌雄比＝1:2的比例放入交配鱼缸内，插上隔板，雌雄斑马鱼分开；隔夜后开灯换水，取出隔板，待30-60分钟后收集鱼卵；

2)收集到的鱼卵置于含有亚甲基蓝的培养皿中，挑选受精鱼卵，按100枚/盘的密度进行分盘，加入胚胎培养液，恒温孵育5小时；

3)恒温孵育后挑出发育状况优良的受精卵分布于12孔板中，随机分为一个空白对照组和三个CdCl₂溶液组，随后放入恒温培养室培养；

4)取步骤3)培养后的样品进行软骨染色或硬骨染色，与空白对照组相比，若CdCl₂溶液组的染色区域减小，即得到斑马鱼骨质疏松模型。

进一步地，所述步骤3)中恒温孵育的温度为28.5℃，时间为5-8天，每天以14小时光照/10小时黑暗的条件进行恒温孵育。

进一步地，所述步骤3)中CdCl₂溶液组包括有CdCl₂和E3培养液，三个CdCl₂溶液组中CdCl₂的浓度分别为0.1μM、1μM和10μM。

进一步地，所述软骨染色的方法具体为：