[发明专利]一种斑马鱼骨质疏松模型的构建方法及其应用

权利要求书

1.一种斑马鱼骨质疏松模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)将性成熟的斑马鱼按雌雄比＝1:2的比例放入交配鱼缸内，插上隔板，雌雄斑马鱼分开；隔夜后开灯换水，取出隔板，待30-60分钟后收集鱼卵；

2)收集到的鱼卵置于含有亚甲基蓝的培养皿中，挑选受精鱼卵，按100枚/盘的密度进行分盘，加入胚胎培养液，恒温孵育5小时；

3)恒温孵育后挑出发育状况优良的受精卵分布于12孔板中，随机分为一个空白对照组和三个CdCl₂溶液组，随后放入恒温培养室培养；

4)取步骤3)培养后的样品进行软骨染色或硬骨染色，与空白对照组相比，若CdCl₂溶液组的染色区域减小，即得到斑马鱼骨质疏松模型。

2.如权利要求1所述的斑马鱼骨质疏松模型的构建方法，其特征在于，所述步骤3)中恒温孵育的温度为28.5℃，时间为5-8天，每天以14小时光照/10小时黑暗的条件进行恒温孵育。

3.如权利要求1所述的斑马鱼骨质疏松模型的构建方法，其特征在于，所述步骤3)中CdCl₂溶液组包括有CdCl₂和E3培养液，三个CdCl₂溶液组中CdCl₂的浓度分别为0.1μM、1μM和10μM。

4.如权利要求1所述的斑马鱼骨质疏松模型的构建方法，其特征在于，所述软骨染色的方法具体为：

a：取步骤3)中受精卵培养第5天后的斑马鱼，用4％PFA固定24小时，用Tris缓冲液/MgCl₂溶液漂洗样品10min，吸干净溶液，随后加入1ml 0.04％阿尔新蓝/MgCl₂溶液室温浸泡过夜、震荡染色；

b：依次分别用含80％、50％、25％乙醇的Tris缓冲液/MgCl₂溶液各漂洗5min进行脱色处理；

c：漂洗完后用等体积的3％H₂O₂和0.5％KOH漂白去色素，每10min观察一次，直到色素漂干净为止；

d：色素漂干净后，用25％甘油/0.1％KOH漂洗10min，漂洗3-4次，之后换新的50％甘油/0.1％KOH溶液浸泡。

5.如权利要求1所述的斑马鱼骨质疏松模型的构建方法，其特征在于，所述硬骨染色的方法具体为：

a：取步骤3)中受精卵培养第8天后的斑马鱼，用4％PFA固定24小时，用Tris缓冲液/MgCl₂溶液漂洗10min；

b：用等体积的3％H₂O₂和0.5％KOH漂白去色素，每10min观察一次，直到色素漂干净为止；

c：用25％甘油/0.1％KOH漂洗10min，漂洗2-3次；随后加入0.01％茜素红S浸泡30min进行硬骨染色；

d：染色完后用50％甘油/0.1％KOH溶液漂洗10min，漂洗2-3次，换新的50％甘油/0.1％KOH溶液浸泡保存。

6.如权利要求4或5所述的斑马鱼骨质疏松模型的构建方法，其特征在于，所述Tris缓冲液的pH值为7.5，浓度为100mM。

7.如权利要求4或5所述的斑马鱼骨质疏松模型的构建方法，其特征在于，所述MgCl₂溶液的浓度为10mM。

8.一种如权利要求1-7所述的斑马鱼骨质疏松模型的构建方法的应用，其特征在于，用于评价和筛选治疗骨质疏松药物。