[发明专利]一种奶牛乳房炎肺炎克雷伯氏菌检测试剂盒及检测方法

权利要求书

1.一种奶牛乳房炎肺炎克雷伯氏菌检测试剂盒，其特征在于：所述的奶牛乳房炎肺炎克雷伯氏菌检测试剂盒包括PCR八连管、干粉状检测试剂，其中所述PCR八连管中各试剂管内均设干粉状检测试剂，且所述干粉状检测试剂与PCR八连管各试剂管上端面间间距不大于PCR八连管各试剂管高度的1/4，且不小于2毫米。

2.根据权利要求1所述的一种奶牛乳房炎肺炎克雷伯氏菌检测试剂盒及检测方法，其特征在于：所述的干粉状检测试剂包括探针、上下游引物、DNTP、Taq聚合酶，具体由以下重量份数物质构成：Tris-HCl（pH=8.3）3%—10%、KCl 3%—8%、MgCl 0.5%—3%、DNTP 1%—4.5%、上游引物 1%—10%、下游引物 1%—10%、探针1%—8%、DMSO 1%—10%、UDG酶 0.1%—0.5%、Taq酶0.2%—5%，余量为甘油。

3.根据权利要求2所述的一种奶牛乳房炎肺炎克雷伯氏菌检测试剂盒及检测方法，其特征在于：所述探针、上下游引物基因序列为：

探针序列为：FAM-CACACTGGAACTGAGACACGGT-BHQ1；

上游引物序列为：CTGGTCTGAGAGGATGAC；

下游引物序列为：CCGCTGAAAGTGCTTTAC。

4.根据权利要求1所述的一种奶牛乳房炎肺炎克雷伯氏菌检测试剂盒及检测方法，其特征在于：所述PCR八连管为25 μL体系。

5.根据权利要求1所述的一种奶牛乳房炎肺炎克雷伯氏菌检测试剂盒的检测方法，其特征在于：所述的奶牛乳房炎肺炎克雷伯氏菌检测试剂盒的检测方法包括如下步骤：

S1，检测预制，首先对PCR八连管进行离心作业，使PCR八连管管壁上的干粉状检测试剂落入到PCR八连管底部，然后向PCR八连管的各试剂管中分别添加3—8 μL的将待检测核酸，然后分别向各试剂管中添加去离子，时各试剂管混合液体积达到25 μL，并对试剂管通过密封盖进行密封处理；

S2，试剂盒运行，完成S1步骤后，驱动试剂盒运行，试剂盒具体运行工作程序为：第一阶段预变性95℃ 15min。第二阶段变性：95℃ 5s,退火60℃ 30s，40个循环，并在60℃时采集荧光；

S3，结果判定，检测结果具体标准为：

检测结果呈现无Ct值，无扩增曲线或反应曲线无明显对数期判定为阴性；

检测结果出现Ct值＜36，并且扩增曲线有明显的对数增长期，判定为荧光PCR阳性；

检测结果出现Ct值36＜Ct值＜40，则需要样品重测。如果复测的Ct值＜40，且扩增曲线有明显的对数增长期，则判定为阳性。

6.根据权利要求5所述的一种奶牛乳房炎肺炎克雷伯氏菌检测试剂盒的检测方法，其特征在于：所述S2步骤中，采集荧光时，报告荧光设定为 FAM，淬灭荧光设置为None。