[发明专利]一种长链非编码RNA-LINC00842原位过表达的阶梯微调方法

说明书

本发明公开一种长链非编码RNA‑LINC00842原位过表达的阶梯微调方法，该方法利用LINC00842特异性的sgRNA定位dCas9到基因组DNA上LINC00842基因的启动子区，通过dCas9融合的VP64结合MS2‑P65‑HSF1，在定位点以不同程度募集转录起始复合体，有效实现梯度调节LINC00842基因的原位过表达；并且，慢病毒系统能够把过表达的所需元件(LINC00842‑sgRNA，dCAS‑VP64，MS2‑P65‑HSF1)整合到细胞的基因组DNA中，跟随细胞分裂复制，实现细wer胞株LINC00842的稳定过表达，最终得到一组稳定过表达不同幅度的LINC00842基因的细胞株系列。

技术领域

本发明涉及一种长链非编码RNA-LINC00842原位过表达的阶梯微调方法，属于原位过表达技术领域。

背景技术

以上调和下调方式研究基因功能非常普遍，其中上调一般通过质粒或病毒载体过表达目的基因实现，上调的量主要取决于所用的方法和载体能够达到的上调幅度，在选定的实验条件下是个相对稳定的量。其实，在细胞复杂的动态信号网络中，基因量变的方向和幅度都会影响细胞的状态和生理功能。目前的常用载体通常能够达到一个相对稳定量的上调，例如：在某种细胞中上调3倍左右；但是使用一个载体难以实现梯度调节目的基因的表达量，例如：依次上调2、3、4倍。通过调节量变幅度来更精细的研究基因功能是未来趋势，所以设计能够不同幅度上调目的基因表达量的载体系统，能为基因功能研究提供有应用价值的工具。

现有的Tet-on/Tet-off调控系统可以通过调节加入药物的剂量和时间，一定程度上调控目的基因表达幅度。例如四环素调控开关，加入一定浓度的四环素可以开启或抑制外源基因的表达。能够被调控的是构建有Tet应答元件的目的基因表达载体，即外源引入的目的基因，而不是细胞自身基因组DNA上的目的基因。所得的表达量也是叠加了细胞自身目的基因表达量后的总和。并且加入的药物，用药计量及其作用时间也是影响细胞的生理或病理状态的变量，特别当研究细胞对其他药物的代谢或应答时，已经加入的诱导药物在一定程度上可能成为干扰变量。

本发明提出一种不借助药物诱导，也不引入外源目的基因拷贝，通过直接作用于细胞自身基因组DNA中的目的基因，来实现梯度调节细胞自身目的基因的表达量方法，相当于一种细胞内原位调控，可以较为简便的获得一组稳定过表达不同幅度的同一目的基因的细胞株系列。(例如：上调2、3、4倍)这样有利于更精细的细胞功能或细胞行为对比研究。

发明内容

本发明的目的在于提供一种长链非编码RNA：LINC00842原位过表达的阶梯微调方法，使用Lenti-CRISPR-dCas9系统从基因组DNA上目标基因的启动子区直接调节转录水平，无需引入外源构建的目的基因，不依赖任何药物诱导，具体为：利用LINC00842特异性的sgRNA定位dCas9到基因组DNA上LINC00842基因的启动子区，通过dCas9融合的VP64结合MS2-P65-HSF1，在定位点以不同程度募集转录起始复合体，实现梯度调节LINC00842基因的原位过表达；并且，慢病毒系统能够把过表达的所需元件LINC00842-sgRNA，dCAS-VP64，MS2-P65-HSF1整合到细胞的基因组DNA中，跟随细胞分裂复制，实现细胞株LINC00842的稳定过表达，最终得到一组稳定过表达不同幅度的LINC00842基因的细胞株系列。

优选的，本发明所述方法具体包括以下步骤：

(1)sgRNA的设计：转录激活sgRNA的设计要求特异性的靶向目的基因启动子区域，在目标物种基因组DNA上无其他结合位点。将转录起始位点及其上游900bp的碱基序列输入设计网站CRISPRdirect，物种选择为智人作为参考基因组，得到能够靶向该区域的所有sgRNA，从中筛选出特异性高的sgRNA序列用于载体构建。

LINC00842过表达sgRNA的序列：

LINC00842-sgRNA-1：TCCCTGTGCCCAGCTAACTG