[发明专利]一种长链非编码RNA-LINC00842原位过表达的阶梯微调方法

权利要求书

1.一种长链非编码RNA-LINC00842原位过表达的阶梯微调方法，其特征在于：使用Lenti-CRISPR-dCas9系统从基因组DNA上目标基因的启动子区直接调节转录水平，无需引入外源构建的目的基因，不依赖任何药物诱导，具体为：利用LINC00842特异性的sgRNA定位dCas9到基因组DNA上LINC00842基因的启动子区，通过dCas9融合的VP64结合MS2-P65-HSF1，在定位点以不同程度募集转录起始复合体，实现梯度调节LINC00842基因的原位过表达；并且，慢病毒系统能够把过表达的所需元件LINC00842-sgRNA，dCAS-VP64，MS2-P65-HSF1整合到细胞的基因组DNA中，跟随细胞分裂复制，实现细胞株LINC00842的稳定过表达，最终得到一组稳定过表达不同幅度的LINC00842基因的细胞株系列。

2.根据权利要求1所述长链非编码RNA-LINC00842原位过表达的阶梯微调方法，其特征在于：具体包括以下步骤：

(1)sgRNA的设计：将转录起始位点及其上游900bp的碱基序列输入设计网站CRISPRdirect，物种选择为人类作为参考基因组，得到能够靶向该区域的所有sgRNA，从中筛选出特异性高的sgRNA序列用于载体构建；

LINC00842过表达sgRNA的序列：

LINC00842-sgRNA-1：TCCCTGTGCCCAGCTAACTG

LINC00842-sgRNA-2：TTGCTCCCCGGAAGACCCCT

LINC00842-sgRNA-3：CAGGTGTCTAAGTTCCCTCG

(2)使用BsmBI消化lenti sgRNA zeo backbone载体，胶回收纯化消化好的载体；对sgRNA退火，将消化好的载体与退火sgRNA进行连接反应；

(3)步骤(2)得到的连接产物直接转化大肠杆菌Stbl3感受态，转化后的菌液涂布于带氨苄抗性的LB培养平板上，静置培养过夜；

(4)从步骤(3)中的培养平板中挑取单克隆，接种于带氨苄抗性的液体培养基中，培养过夜，经过测序鉴定得到插入sgRNA的载体lenti sgRNA；

(5)步骤(4)得到的载体和包装载体一同使用包装慢病毒，然后利用包装好的慢病毒感染目的细胞。

3.根据权利要求2所述长链非编码RNA-LINC00842原位过表达的阶梯微调方法，其特征在于，所述慢病毒包装的具体过程为：

(1)提前24小时用多聚赖氨酸poly-L-lysine包被细胞培养皿并晾干，以促进包装细胞贴壁；

(2)将5-8×10⁶数量级的包装细胞293T细胞悬于10ml完全培养基，铺到前期用多聚赖氨酸包被过的10cm²培养皿中；

(3)第二天当细胞融合度达到65％～80％时，弃去培养基用无菌PBS洗3遍，更换为含10％FBS的无抗生素培养基；

(4)将pVSVG包膜质粒，pSPAX包装质粒及目的基因质粒按比例混合于无抗生素无血清的opti-MEM培养基中；各质粒比例：pVSVG:1μg，pSPAX:3μg，lenti dCAS-VP64_Blast:1.5μg，lenti MS2-P65-HSF1_Hygro：1.5μg,lenti sgRNA(MS2):1.5μg，如果使用多个sgRNA组合，则各个sgRNA等比例混合；

(5)转染试剂Lipofectamine 2000，提前溶于等体积的无抗生素无血清的opti-MEM培养基中，随后与质粒混合体系充分混匀，室温静置反应20-30min，形成的DNA脂质体复合物均匀滴加到包装细胞培养皿中转染包装细胞；

(6)24小时后更换完全培养基，随后的48、72小时收获含慢病毒的培养上清病毒培养上清需分装后于-80℃保存。

4.根据权利要求2所述长链非编码RNA-LINC00842原位过表达的阶梯微调方法，其特征在于，所述用慢病毒载体感染目的细胞的具体过程为：

(1)慢病毒培养上清静置于冰上缓慢化冻，化冻后仍然置于冰上；

(2)含慢病毒的培养上清需与等体积的完全培养基混匀以补充营养物质，并添加基因转染增强剂polybrene至最终浓度为8ug/ml；

(3)目的细胞提前一天传代，当目的细胞达到55-75％融合度时弃去原培养液，加入混合好的慢病毒培养上清，让病毒感染目的细胞，培养过夜后首先用无菌PBS洗3遍，然后更换为完全培养基让目的细胞继续生长；

(4)感染72小时后收获细胞用于后续检测。