[发明专利]一种潜隐病毒基因组的提取方法

说明书

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种潜隐病毒基因组的提取方法，利用植物病毒衣壳蛋白和植物细胞蛋白的等电点差异，病原遗传物质的特点，以及不同植物病毒对PEG浓缩的需求。采用PEG包裹的磁核，从感染了4种病原体的桑树叶片中成功分离到了潜隐病毒基因组，通过半定量和定量PCR均证实所获的基因组纯度较高、浓度较大，可以用于PCR实验和高通量测序。解决了木本植物中潜隐病毒病原体含量低，指示植物少，纯化困难的问题。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种潜隐病毒基因组的提取方法。

背景技术

病毒往往给人类造成巨大的伤害，农林植物因为病毒为害而遭受重大损失的例子也是举不胜举，如水稻东格鲁病毒、马铃薯Y病毒、麦类黄矮病毒等。

病毒是一种非细胞生物，其形态小，结构简单，人们在光学显微镜下无法观察，因而病毒的分类纯化对于病毒的研究来说显的特别重要。病毒不能像其他微生物那样通过选择性培养基来进行培养，也不能像细菌那样在培养基上繁殖扩大提纯，因此必须将病毒从寄主的组织中提取出来。由于病毒刺激植物吸引昆虫等媒介，造成田间采集的感染病毒的样本往往混杂几种病毒，如马铃薯的Y病毒和S病毒的混合侵染率80％以上。这也造成了植物病毒纯化的困难性。

目前，病毒的分离主要有以下几种方法：

离心法，是人们最早采用的方法，主要是利用了病毒粒子和细胞碎片的密度差异，但是提纯的病毒杂质非常多，高速和超高速离心机问世后，人们才获得了较为满意的提纯效果，并在此基础上发展了差速离心法和密度梯度离心法，但是这些大型设备非常昂贵，而且对病毒的浓度要求较高，5-10mg/kg浓度是该方法提纯的最低限，而且往往需要多次实验才能得到纯化的病毒。

沉淀法，主要是利用在一定的粒子浓度下，PEG可以使得病毒沉淀，但是不同的病毒种类所需要的PEG浓度差异很大，比如4％的PEG可以沉淀烟草花叶病毒，11％的PEG可以沉淀马铃薯S病毒，况且PEG也可以沉淀一部分非病毒物质，造成纯化的病毒含有较多的杂质，而且PEG沉淀法必须结合低速离心，造成病毒粒子容易聚合不能沉淀而被离心丢失。同时该方法需要用到有机澄清剂，容易给操作人员造成危害。

电荷法，病毒粒子可以直接吸附到聚乙烯或聚苯乙烯表面，就可以直接利用聚乙烯离心管捕捉病毒粒子，但是该方法的非特异性太差，获得的基因组种类和量均太少。

免疫法，该方法利用了抗原和抗体的特异性结合，它以抗体包裹的磁珠或者其他易于分离的介质为载体，通过抗体与抗原的反应，形成抗原-抗体-介质复合物，此复合物在磁场或其他可以分离介质的外力下，发生定向移动，达到分离的目的，所获得的病毒纯度较高，但是该方法必须要知晓病毒的衣壳蛋白并制备多克隆抗体，需要的周期较长。

过滤法，利用病毒外壳蛋白分子量的大小，对病毒粒子进行离心和沉淀纯化后，以Cutoff为3KDa的透析袋进行透析，但是该方法以获得蛋白为主要目的，操作周期较长，仅透析就要3d，病毒的基因组降解严重。

综上，现有技术存在的问题是，提取的潜隐病毒基因组杂质多、提取量不够或者提取周期长。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种潜隐病毒基因组的提取方法。

本发明的目的是提供一种潜隐病毒基因组的提取方法，包括：

步骤一、样品预处理

采集感染潜隐病毒的桑树叶片，冷冻7-15天，然后将桑树叶片与PBS缓冲液按照1g:5-15mL混合研磨成浆，获得样品溶液；

步骤二、病毒的浓缩

样品溶液经3000-10000r离心，去除沉淀，取上清得病毒提取液；

步骤三、磁珠活化